專(zhuān)利名稱(chēng)：10－脫乙酰巴卡亭iii的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從紅豆杉枝葉中高效提取10-脫乙酰巴卡亭III的方法。
背景技術(shù)：
紫杉烷類(lèi)化合物是一類(lèi)具有二萜母核結(jié)構(gòu)的化合物，在自然界它主要存在于紅豆杉枝葉中。
1971年Wani等(Wani Mc，et al，J.A.C.S.93，2325，1971.)從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)樹(shù)皮中首次提取得到屬于所述紫杉烷類(lèi)化合物的紫杉醇，其結(jié)構(gòu)式如下 已知紫杉醇對(duì)B-16黑色素瘤、L-1210和P-388白血病、MX-1乳腺癌和異種移植的CX-1結(jié)腸癌等許多腫瘤模型顯示極強(qiáng)的抗癌活性，其作用機(jī)理為它能促使微管蛋白聚合成微管，并在其存在下微管不再解體，使癌細(xì)胞限制在構(gòu)架組織內(nèi)而死亡[Dentsch-HM et al，J.M.C.32(4)，788，1989；Manfredi JJ，et al，Phannacolther 25，83，1984]。1992年12月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)BMS公司的紫杉醇作為轉(zhuǎn)移性卵巢癌的二線治療藥；1993年12月又批準(zhǔn)該藥作為晚期乳腺癌治療藥，目前該藥已經(jīng)在二十多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)上市。
中國(guó)專(zhuān)利CN1124735A公開(kāi)了一種紫杉醇的提取方法，它包括混合溶劑浸出、濃縮、溶劑提取、硅膠柱層析后獲粗產(chǎn)品，再經(jīng)重結(jié)晶純化和柱層析分離，獲得純度超過(guò)98％的紫杉醇，得率十萬(wàn)分之七左右。
專(zhuān)利國(guó)際申請(qǐng)WO00/78741公開(kāi)了一種紫杉醇的提取方法，它包括用有機(jī)溶劑浸提紅豆杉獲得含紫杉醇的粗提物，將粗提物用酸或堿處理，通過(guò)沉淀得到生物質(zhì)，去除其中的樹(shù)脂和天然色素，再經(jīng)溶劑萃取獲得富含紫杉醇的有機(jī)相，再經(jīng)堿或酸處理后，通過(guò)色譜分離、重結(jié)晶等處理，得到92％～99％的紫杉醇產(chǎn)品。
目前提取天然紫杉醇的方法包括先從紅豆杉枝葉中提取紫杉烷類(lèi)化合物的混合物，再?gòu)乃龌旌衔镏蟹蛛x紫杉醇。所述提取紫杉烷類(lèi)化合物的方法一般包括如下步驟(1)在容器中裝入經(jīng)干燥和粉碎的紅豆杉枝葉，用浸提液浸泡一段時(shí)間；(2)液-固分離后，再加入浸提液對(duì)分離的固體再次進(jìn)行浸泡，分離得到浸提液；(3)重復(fù)步驟(2)。
這種多級(jí)浸泡法的缺點(diǎn)是所需時(shí)間長(zhǎng)，浸提液用量大，從而使得到的產(chǎn)品濃度低，后續(xù)除去溶劑的工作量大，限制了浸提效率。
因此，需要開(kāi)發(fā)一種從紅豆杉枝葉中高效提取紫杉烷類(lèi)化合物的方法。
目前認(rèn)為紫杉醇的活性結(jié)構(gòu)是其分子結(jié)構(gòu)中的C-13位側(cè)鏈以及C-4、C-5、C-20位的環(huán)氧丙烷結(jié)構(gòu)[陳未名等，藥學(xué)學(xué)報(bào).1990，25(3)27] 由于紫杉醇療效顯著，使其需求量很大。目前紫杉醇主要靠從紅豆杉中分離提取。紅豆杉生長(zhǎng)非常緩慢，并且在其樹(shù)皮中紫杉醇的含量一般僅在0.01～0.03重量％之間，在紅豆杉枝葉中紫杉醇的含量更低。因此，天然紫杉醇的產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足要求。有必要尋找新的紫杉醇來(lái)源或者其替代品。
10-脫乙酰巴卡亭III(10-DABIII)也是從紅豆杉中分離得到的天然有機(jī)化合物，被用于合成抗癌藥物紫杉醇和多烯紫杉醇，其結(jié)構(gòu)如下 為了得到更多的紫杉醇原料，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了利用組織培養(yǎng)、半合成以及全合成等方法來(lái)獲取紫杉醇的研究，在這些方法中，組織培養(yǎng)獲得的產(chǎn)量小，產(chǎn)業(yè)化可行性還不成熟；全合成得率低且成本巨大，也難以進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化；而利用10-脫乙酰巴卡亭III進(jìn)行半合成紫杉醇及多烯紫杉醇卻是簡(jiǎn)便易行，而且在紅豆杉枝葉中10-脫乙酰巴卡亭III的含量較高，一般在0.01％～0.08％之間，在加拿大紅豆杉的枝葉中10-脫乙酰巴卡亭III的含量可達(dá)0.07％～0.08％，是紫杉醇含量的四倍以上，加之枝葉為可再生資源，因此利用10-脫乙酰巴卡亭III為起始原料半合成紫杉醇及多烯紫杉醇的方法具有廣闊的前景和商業(yè)價(jià)值。
以10-脫乙酰巴卡亭III為原料半合成的藥物多烯紫杉醇現(xiàn)已被批準(zhǔn)上市，用于乳腺癌、卵巢癌等癌癥的治療。因此有必要從紅豆杉枝葉中快速高效地分離純化10-脫乙酰巴卡亭III。目前大部分的10-脫乙酰巴卡亭III的分離純化是利用乙醇、甲醇或水浸提樹(shù)皮或者枝葉，然后再用萃取進(jìn)行純化，最后用結(jié)晶或者色譜分離的方法得到高純度的10-脫乙酰巴卡亭III。
Ramadoss等(USP.6,124,482)公開(kāi)了一種10-脫乙酰巴卡亭III的方法，它先用脂肪醇浸提歐洲紅豆杉的干燥樹(shù)葉，提取液濃縮后用脂肪酮萃取，去除不溶物，然后把母液蒸干，得到的固體用水和酮的混合液溶解，去除不溶物，經(jīng)脫色，再利用有機(jī)溶劑萃取，有機(jī)層結(jié)晶得到純度為93.5～94.1％的10-脫乙酰巴卡亭III。
Hargraff等(USP.5,736,366)提到用水浸提歐洲紅豆杉，調(diào)節(jié)提取液的pH值至4.6-5.5，利用固相萃取分離10-脫乙酰巴卡亭III，結(jié)晶得到產(chǎn)品得純度在75～90％，得率約為75.4～92％之間。
Gaullier等(USP.5,453,521、USP.5,393,895)公開(kāi)了用脂肪醇浸提歐洲紅豆杉的樹(shù)葉，用水稀釋溶液，去除不溶物，完全除掉酒精，用有機(jī)溶劑萃取水層，結(jié)晶得到產(chǎn)品純度為75.8～93.8％，得率為69.5～93.8％。
Nair等(USP.5,478,736)用50～95％的甲醇、乙醇或者丙酮的水溶液浸提紅豆杉的組織，得到的浸提液用活性碳過(guò)濾，利用真空加壓的正相色譜柱分離，再用中壓色譜柱分離，收集相應(yīng)餾分，得到10-脫乙酰巴卡亭III。
專(zhuān)利國(guó)際申請(qǐng)WO94/07882中公開(kāi)了用甲醇浸提紅豆杉組織，得到的浸提液用水稀釋?zhuān)コ蝗芪?，除盡甲醇后得到的溶液用合適的有機(jī)溶劑萃取，結(jié)晶得到10-脫乙酰巴卡亭III的純度為95.8％，得率為93.6％。
中國(guó)專(zhuān)利CN1377882A中用甲醇或乙醇浸提紅豆杉組織，回收溶劑后用乙酸乙酯溶解醇提取物，再以碳酸氫鈉溶液反萃取去除雜質(zhì)，回收溶劑后用乙腈溶解殘?jiān)?，冷凍結(jié)晶得到10-脫乙酰巴卡亭III，結(jié)晶母液經(jīng)過(guò)反相色譜，正相色譜分離得到紫杉醇和三尖杉寧堿。
但是，上述文獻(xiàn)采用的浸提方法均是常規(guī)的溶劑浸提法，存在溶劑消耗量大的缺點(diǎn)。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種從紅豆杉中提取10-脫乙酰巴卡亭III的方法。
因此，本發(fā)明提供一種從紅豆杉中提取10-脫乙酰巴卡亭III的方法，它包括如下步驟(1)用多級(jí)連續(xù)滲漉提取法用有機(jī)浸提液對(duì)紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提，得到含紫杉烷類(lèi)化合物的有機(jī)浸提溶液；(2)除去有機(jī)浸提溶液中的有機(jī)溶劑，得到水性浸提液；(3)用極性有機(jī)溶劑對(duì)所述水性浸提液進(jìn)行萃取，得到有機(jī)萃取液；(4)除去萃取液中的有機(jī)溶劑，得到含所述紫杉烷類(lèi)化合物的浸膏；(5)對(duì)所述浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以乙酸C1-C6烷酯洗脫，得到含10-脫乙酰巴卡亭III的溶液。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是本發(fā)明多級(jí)連續(xù)滲漉提取的示意圖；圖2是本發(fā)明一個(gè)較好實(shí)例中的分離純化流程圖；圖3是本發(fā)明一個(gè)較好實(shí)例的滲漉桶的示意圖。
具體實(shí)施例方式
下面參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
本發(fā)明10-脫乙酰巴卡亭III的提取方法是由二部分組成的1.提取紫杉烷類(lèi)化合物紫杉烷類(lèi)化合物的提取方法包括用多級(jí)連續(xù)滲漉提取法對(duì)紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提。所述多級(jí)連續(xù)滲漉提取法如圖1所示，它包括多個(gè)串聯(lián)的滲漉段，使用時(shí)先在各個(gè)滲漉段加入一定量經(jīng)干燥的紅豆杉枝葉，隨后向第一滲漉段緩慢地加入浸提液，該浸提液流經(jīng)第一滲漉段的紅豆杉枝葉后流向第二滲漉段。在后續(xù)加入的浸提液的驅(qū)動(dòng)下浸提液逐漸流向最后一個(gè)滲漉段。在浸提液流經(jīng)最后一個(gè)滲漉段后，收集一定量的浸提液，停止向第一滲漉段加入浸提液而改向第二滲漉段加入浸提液，即此時(shí)第二滲漉段升格為第一滲漉段。原先的第一滲漉段卸料后加入新的未浸提的紅豆杉枝葉作為最后一個(gè)滲漉段。
停止向第一滲漉段加入浸提液而改成向第二滲漉段加入浸提液的時(shí)機(jī)取決于滲漉段所含的紅豆杉枝葉的量以及浸提液的流量。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)流經(jīng)最后一個(gè)滲漉段而收集得到的浸提液體積(單位為毫升)達(dá)到平均每一個(gè)滲漉段所含紅豆杉枝葉重量(單位為克)的1-3倍，較好1.5-2.5倍，最好為2倍時(shí)，就可實(shí)施所述浸提液加料轉(zhuǎn)換。
本發(fā)明方法中，所述浸提液可以以連續(xù)的方式加入，也可以以間歇的方式加入。
在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，紅豆枝葉原料平均放置在各個(gè)滲漉段，當(dāng)流經(jīng)最后一級(jí)滲漉段而收集得到的浸提液體積(ml)達(dá)到每一個(gè)滲漉段所含紅豆杉枝葉重量(g)的1-3倍時(shí)，停止向第一級(jí)滲漉段加入提取液，并在最后一級(jí)再增加一個(gè)滲漉段，隨后向第二級(jí)滲漉段加入提取液。此時(shí)，新增加的滲漉段可以是原第一級(jí)滲漉段卸料后再加入新的紅豆杉枝葉后形成的。
實(shí)施本發(fā)明多級(jí)連續(xù)滲漉提取的滲漉裝置無(wú)特別的限制。在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，使用如圖3所示的滲漉桶。
圖3所示的滲漉桶包括料筒1、底層篩網(wǎng)2和任選的閥門(mén)3。所述料筒通常由不銹鋼、玻璃、陶瓷等材料制成，它可以是直筒形的，也可以是喇叭形(例如側(cè)面和底面呈120-130℃，較好125℃的夾角)的。料筒1的底面具有一層篩網(wǎng)2，篩網(wǎng)的網(wǎng)孔大小無(wú)特別的限制，取決于所需的浸提液流量和紅豆杉枝葉的粉碎程度。在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，所述篩網(wǎng)是20目的不銹鋼篩網(wǎng)。
滲漉桶篩網(wǎng)下方還可任選地包括一個(gè)閥門(mén)，從而當(dāng)該滲漉桶退出滲漉流程時(shí)可關(guān)閉閥門(mén)，以免內(nèi)部殘留物流出而造成污染。
所述多級(jí)連續(xù)滲漉提取法的級(jí)數(shù)無(wú)特別限制，但是從經(jīng)濟(jì)性的角度考慮，所述多級(jí)連續(xù)滲漉提取法較好為4-15級(jí)，更好為6-12級(jí)，最好為10級(jí)。
在浸提前需要對(duì)紅豆杉枝葉進(jìn)行干燥。干燥的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。其非限定性例子包括加熱干燥。干燥后紅豆杉枝葉的含水量無(wú)特別的限制。但是，如果含水量太高，則會(huì)降低制得的紫杉烷類(lèi)化合物水性浸提液的濃度，造成后處理困難；含水量太低，則會(huì)增加干燥所需的成本。因此，一般來(lái)說(shuō)，含水量宜為5％～15重量％，較好為10重量％。
本發(fā)明多級(jí)連續(xù)滲漉法使用有機(jī)溶劑作為浸提液。所述有機(jī)溶劑無(wú)特別的限制，只要它能浸提紅豆杉枝葉中的紫杉烷類(lèi)化合物即可。所述有機(jī)溶劑的非限定性例子包括醇，較好是C1-6脂肪醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇或它們的50-100％的水溶液；酮，例如丙酮或其50-100％水溶液、甲乙酮或其50-100％水溶液、丁酮、環(huán)己酮；醚，例如乙醚或其50-100％水溶液、甲基乙基醚或其50-100％水溶液；酯，例如乙酸C1-4烷酯，如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯。在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，所述有機(jī)溶劑是濃度為50-100％的甲醇、乙醇或丙酮的水溶液。
為了增加接觸表面以提高滲漉效率，一般預(yù)先將紅豆杉枝葉粉碎成例如粒徑為0.5-5mm，較好為1-2mm的粉末。
用本發(fā)明有機(jī)浸提液得到含紫杉烷類(lèi)化合物的有機(jī)浸提溶液后，除去所述有機(jī)浸提溶液中的有機(jī)溶劑，由于紅豆杉枝葉中含有水分或者使用含水浸提液的緣故，因此得到的是紫杉烷類(lèi)化合物的水性浸提液(也稱(chēng)為含水粗浸膏)。所述除去有機(jī)溶劑的方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，例如它可以是加熱揮發(fā)或減壓蒸餾的方法。
用上述方法得到的紫杉烷類(lèi)化合物的含水粗浸膏含有許多非紫杉烷類(lèi)化合物雜質(zhì)。為了提高紫杉烷類(lèi)化合物浸膏的純度，本發(fā)明方法還可包括用極性有機(jī)溶劑對(duì)其進(jìn)行萃取的步驟，在實(shí)施所述萃取步驟時(shí)，先向得到的紫杉烷類(lèi)化合物含水浸膏中加入一定量的水，隨后進(jìn)行萃取。所述水的加入量無(wú)特別的限制，只要能達(dá)到萃取的目的即可。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)具體情況可容易地確定水的加入量。在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，水的加入量為含水浸膏體積的0.5-2倍，較好為1倍。萃取步驟使用的極性有機(jī)溶劑無(wú)特別的限制，只要該溶劑能作為萃取劑從水溶液中萃取紫杉烷類(lèi)化合物即可。所述萃取劑的例子包括低級(jí)鹵代烴，例如氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、氯乙烷，1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷等，較好是三氯甲烷。
本發(fā)明用于滲漉的溫度可以是常溫，也可以在升溫下進(jìn)行以提高滲漉的效率。但是，浸提溫度應(yīng)低于浸提液中有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)，以免有機(jī)物沸騰而影響滲漉效率。
本發(fā)明每一個(gè)滲漉段還可裝有攪拌裝置，以進(jìn)一步提高浸提液與紅豆杉枝葉的接觸表面，提高浸提率。
本發(fā)明紫杉烷類(lèi)化合物的提取率是以10-脫乙酰巴卡亭III為基準(zhǔn)測(cè)定的，其測(cè)試方法如下取10g樹(shù)粉以樹(shù)粉8倍重量的95％的乙醇多次超聲提取，每次2小時(shí)，直至提取液以HPLC法檢測(cè)不到10-脫乙酰巴卡亭III的峰存在，將提取液合并，回收，定容于100mL容量瓶，以HPLC法測(cè)定10-脫乙酰巴卡亭III含量(外標(biāo)法，參見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版二部附錄VD)，得到樹(shù)粉中10-脫乙酰巴卡亭III的含量。另取相當(dāng)于10g樹(shù)粉的多級(jí)滲漉提取所得的滲漉液，按上述方法定容于100mL容量瓶，以HPLC法測(cè)定10-脫乙酰巴卡亭III含量，與樹(shù)粉中的含量相比即得提取率。
本發(fā)明提取方法具有提取效率高(它可將紅豆杉枝葉中99％以上的紫杉烷類(lèi)化合物提取至浸膏中)，提取時(shí)間短(提取時(shí)間比傳統(tǒng)浸提法縮短兩倍以上)，溶劑用量少(該法溶劑用量為傳統(tǒng)浸提法溶劑用量的十分之一～十六分之一)的優(yōu)點(diǎn)，從而降低了制造成本并且有助于環(huán)境保護(hù)。
在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，所述提取方法包括如下步驟1)將紅豆杉枝葉自然干燥至含水量為10重量％，粉碎成粒徑為1～2毫米的粉末；2)在10級(jí)連續(xù)滲漉提取段中用濃度為50％～100％的甲醇、乙醇或丙酮的水溶液對(duì)紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提，得到濃滲漉液；3)將所述濃滲漉液減壓蒸發(fā)至溶液中基本沒(méi)有甲醇、乙醇或丙酮后得到含水粗浸膏；4)向該含水粗浸膏中加入等體積水稀釋?zhuān)月确螺腿≡撓♂屢海?)回收氯仿得浸膏，按紅豆枝葉的總重量計(jì)，紫杉烷類(lèi)化合物提取率大于95重量％的浸膏得率為5～10重量％。
所述浸膏得率是將最終得到的干浸膏(紫杉烷類(lèi)化合物提取率大于95重量％)的重量除以用于浸提經(jīng)干燥的紅豆杉枝葉總重量計(jì)的。由于本發(fā)明采用連續(xù)滲漉提取法，因此，所述用于浸提的經(jīng)干燥的紅豆杉枝葉總重量為連續(xù)滲漉浸提的各級(jí)(n)中經(jīng)干燥的紅豆杉枝葉裝填量(m)的總和 2.從所述紫杉烷類(lèi)化合物中提取10-脫乙酰巴卡亭III本發(fā)明從上面所述浸膏中提取10-脫乙酰巴卡亭III的方法包括對(duì)所述浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以乙酸C1-C6烷酯洗脫，得到10-脫乙酰巴卡亭III。
本發(fā)明方法中使用的硅膠柱層析法無(wú)特別的限制，它可以是本領(lǐng)域常用的硅膠柱層析法。在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，所述硅膠柱層析法使用的硅膠購(gòu)自山東芝罘硅膠廠。
在進(jìn)行硅膠柱層析分離前用于溶解含紫杉烷類(lèi)化合物浸膏的溶劑無(wú)特別的限制，只要該溶劑能夠溶解所述浸膏并且能使所述溶液中的10-脫乙酰巴卡亭III吸附在硅膠柱上即可。所述溶劑的非限定性例子有乙酸乙酯，二氯甲烷，氯仿或其混合混合物。
用于洗脫10-脫乙酰巴卡亭III的洗脫液為乙酸C1-C6烷酯。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“乙酸C1-C6烷酯”是指乙酸C1-C6直鏈或支鏈烷酯，例如甲酯、乙酯、丙酯、異丙酯、丁酯、叔丁酯、戊酯、異戊酯、己酯等。較好為乙酸C1-C4烷酯，如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯和乙酸異丙酯，更好為乙酸乙酯。
在洗脫前，可使用4∶1-1∶1(v/v)的C4-C8烷烴-乙酸C1-C6烷酯，較好為3∶1-1.5∶1(v/v)的C4-C8烷烴-乙酸C1-C6烷酯，或者可使用4∶1-1∶1(v/v)的石油醚-乙酸C1-C6烷酯，較好為3∶1-1.5∶1(v/v)的石油醚-乙酸C1-C6烷酯預(yù)先洗脫雜質(zhì)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“C4-C8烷烴”是指具有4-8個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷烴或環(huán)烷烴，例如正丁烷、異丁烷、叔丁烷、正戊烷、異戊烷、正己烷、環(huán)己烷和正庚烷、正辛烷等。
在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，使用2∶1(v/v)的正己烷-乙酸乙酯作為預(yù)洗脫液洗脫雜質(zhì)。在本發(fā)明另一個(gè)較好實(shí)例中，使用1∶1(v/v)的正己烷-乙酸乙酯洗脫8-9個(gè)柱體積以去除雜質(zhì)，隨后用乙酸乙酯洗脫得到含10-脫乙酰巴卡亭III的部分。
接著除去得到的10-脫乙酰巴卡亭III粗溶液中的溶劑，得到含10-脫乙酰巴卡亭III的干浸膏。所述除去溶劑的方法無(wú)特別的限制，可以是本領(lǐng)域的任何方法，只要其對(duì)10-脫乙酰巴卡亭III產(chǎn)品無(wú)不利影響即可。例如，它可以采用蒸發(fā)、噴霧干燥等方法。
得到的10-脫乙酰巴卡亭III產(chǎn)品中含有許多雜質(zhì)，例如7-β-木糖基紫杉醇。因此，需要用乙酸C1-C6烷酯或者乙腈對(duì)其溶劑處理。用于處理的溶劑的量為干浸膏重量的1.5-2.2倍，較好為2倍。在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，所述溶劑處理包括以干浸膏兩倍的重量加入乙酸乙酯，攪拌以溶解雜質(zhì)，過(guò)濾，得到10-脫乙酰巴卡亭III。
為了得到高純度的10-脫乙酰巴卡亭III產(chǎn)品，還可對(duì)得到的10-脫乙酰巴卡亭III粗品進(jìn)行純化。所述純化方法無(wú)特別的限制，可以是本領(lǐng)域常規(guī)的純化方法。在本發(fā)明的一個(gè)較好實(shí)例中，所述純化方法是重結(jié)晶法。它使用4∶1-1∶1(v/v)的C4-C8烷烴-乙酸C1-C6烷酯，較好為3∶1-1.5∶1(v/v)的C4-C8烷烴-乙酸C1-C6烷酯，或者可使用4∶1-1∶1(v/v)的石油醚-乙酸C1-C6烷酯，較好為3∶1-1.5∶1(v/v)的石油醚-乙酸C1-C6烷酯作為溶劑。所述C4-C8烷烴-乙酸C1-C6烷酯的非限定性例子有正己烷-乙酸乙酯、正丁烷-乙酸甲酯、正戊烷-乙酸丙酯等。
圖2是本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中所述10-脫乙酰巴卡亭III分離方法的流程圖。它包括對(duì)含紫杉烷類(lèi)化合物的混合物的浸膏進(jìn)行硅膠柱色譜分離，得到10-脫乙酰巴卡亭III粗品，隨后對(duì)得到的粗品進(jìn)行重結(jié)晶。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例測(cè)試方法10-脫乙酰巴卡亭III提取率本發(fā)明10-脫乙酰巴卡亭III提取率的測(cè)試方法如下取10g樹(shù)粉以樹(shù)粉8倍重量的95％的乙醇多次超聲提取，每次2小時(shí)，直至提取液以HPLC法檢測(cè)不到10-脫乙酰巴卡亭III的峰存在，將提取液合并，回收，定容于100mL容量瓶，以HPLC法測(cè)定10-脫乙酰巴卡亭III的量(外標(biāo)法，參見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版二部附錄VD)，得到樹(shù)粉中10-脫乙酰巴卡亭III的含量。
另取相當(dāng)于10g樹(shù)粉的多級(jí)滲漉提取所得的滲漉液，按上述方法定容于100mL容量瓶，以HPLC法測(cè)定10-脫乙酰巴卡亭III含量，與樹(shù)粉中的含量相比即得提取率。
2. 10-脫乙酰巴卡亭III純度的測(cè)定以HPLC法測(cè)定10-脫乙酰巴卡亭III的純度(外標(biāo)法，參見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版二部附錄VD)；實(shí)施例中所用的高效液相色譜儀為日本島津公司生產(chǎn)的LC-10A泵和SPD-10A紫外檢測(cè)器。
實(shí)施例1A.制備浸膏取1Kg經(jīng)自然干燥至含水量為10重量％的加拿大紅豆杉莖葉，粉碎成粒度為1～2毫米的粉末，另取十只250ml的滲漉桶，每只滲漉桶裝入50g樹(shù)粉，按圖1所示，以間歇的方式往第一只滲漉捅中加入100ml 95％的乙醇溶液，滲漉液在流經(jīng)第一只滲漉捅后流入第二只滲漉桶，依次類(lèi)推，第一只滲漉桶中不斷加入100ml 95％的乙醇溶液，直至第十只滲漉桶滲漉完畢，收集第十只滲漉桶的滲漉液直至達(dá)到100ml，停止向第一只滲漉桶中加入滲漉液，改成往第二只滲漉桶中加入100ml 95％的乙醇溶液，第一只滲漉桶卸料后加入50g干燥樹(shù)粉作為新的最后一級(jí)滲漉段，即將第十只滲漉桶的第二次滲漉液加入第一只滲漉桶，再收集第一只滲漉桶的第一次滲漉液，達(dá)到100ml后，停止向第二只滲漉桶加入滲漉液，改成往第三只滲漉桶中加入100ml95％的乙醇溶液，第二只滲漉桶卸料后加入50g干燥樹(shù)粉，依次類(lèi)推。合并500g樹(shù)粉的濃滲漉液共計(jì)1000ml，減壓回收至無(wú)醇味，加水稀釋至約500ml，以100ml氯仿萃取三次，水相以HPLC檢查基本無(wú)10-脫乙酰巴卡亭III的峰。減壓回收氯仿萃取液，得浸膏30g。
用上述方法測(cè)定浸膏中紫杉烷類(lèi)化合物的提取率，結(jié)果紫杉烷類(lèi)化合物的提取率為99％。該浸膏提取過(guò)程共耗時(shí)約8小時(shí)。
B.分離10-脫乙酰巴卡亭III對(duì)30克步驟A所得浸膏溶解在乙酸乙酯溶劑中進(jìn)行硅膠柱層析，使用的硅膠購(gòu)自山東芝罘硅膠廠，用4∶1的石油醚-乙酸乙酯預(yù)洗脫8-9個(gè)柱體積以除去雜質(zhì)，隨后用乙酸乙酯洗脫10-脫乙酰巴卡亭III部分，回收溶劑得到含10-脫乙酰巴卡亭IH的干浸膏。
以兩倍重量向所述干浸膏中加入乙酸乙酯，攪拌后過(guò)濾得到10-脫乙酰巴卡亭III的粗品。
將得到的粗品用4∶1的石油醚-乙酸乙酯洗滌，得到0.45g白色粉末，NMR確認(rèn)其為10-脫乙酰巴卡亭III，產(chǎn)品純度為96％，提取率為99％。
1H-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ16～19CH31.63(3H，S)，1.42(3H，S)，2.42(3H，S)，2.15(3H，S)；OAc(CH3)2.23(3H，S)。
13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ(1～20)78.3，76.0，48.1，81.2，84.6，36.4，72.2，57.3，209.6，75.4，135.4，143.3，67.4，40.8，43.6，20.6，27.4，15.5，12.7，76.5，OBzC＝O166.3，131.3，128.6，130.2，133.1，OAc(CH3)20.6，(C＝O)170.4。
比較例1將500g與上述實(shí)施例1相同的紅豆杉枝葉粉末置于一容器中，每次以8倍樹(shù)粉重量的乙醇浸提，提取四次，每次5小時(shí)，得到95％的乙醇溶液16000mL，提取時(shí)間為20小時(shí)。用與實(shí)施例1相同的方法將該乙醇溶液減壓回收至無(wú)醇味，加水稀釋至約500ml，以100ml氯仿萃取三次，水相以HPLC檢查基本無(wú)10-脫乙酰巴卡亭III的峰。減壓回收氯仿萃取液，得浸膏30g。用上述方法測(cè)定浸膏中紫杉烷類(lèi)化合物的提取率，結(jié)果紫杉烷類(lèi)化合物的提取率為95％。
實(shí)施例2A.制備浸膏取10Kg經(jīng)自然干燥至含水量為5重量％的加拿大紅豆杉莖葉，粉碎成粒度為2-5毫米的粉末，另取八只2500ml的滲漉桶，每只滲漉桶裝入500g樹(shù)粉，按圖1所示，以連續(xù)的方式緩慢地往第一只滲漉捅中加入95％的甲醇溶液，滲漉液加入第二只滲漉桶，依次類(lèi)推，每次收集的滲漉液的體積為500ml，用與實(shí)施例1相同的方法，但是使用氯甲烷代替氯仿進(jìn)行萃取，共得浸膏320g。
用上述方法測(cè)定浸膏中紫杉烷類(lèi)化合物的提取率，結(jié)果紫杉烷類(lèi)化合物的提取率為99％。
B.分離10-脫乙酰巴卡亭III對(duì)30克步驟A所得浸膏溶解在乙酸乙酯溶劑中進(jìn)行硅膠柱層析，使用的硅膠購(gòu)自山東芝罘硅膠廠，用1∶1的正己烷-乙酸甲酯預(yù)洗脫8-9個(gè)柱體積，再用乙酸乙酯洗脫，收集含10-脫乙酰巴卡亭III的部分，回收溶劑得到10-脫乙酰巴卡亭III的干浸膏。
以1.6倍重量向所述干浸膏中加入乙酸乙酯，攪拌后過(guò)濾，得到10-脫乙酰巴卡亭III的粗品。
將得到的粗品用1∶1的正己烷-乙酸甲酯洗滌，得到0.46g白色粉末，NMR確認(rèn)其為10-脫乙酰巴卡亭III，產(chǎn)品純度為97.8％，提取率為99.2％。
1H-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ16～19CH31.63(3H，S)，1.42(3H，S)，2.42(3H，S)，2.15(3H，S)；OAc(CH3)2.23(3H，S)。
13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ(1～20)78.3，76.0，48.1，81.2，84.6，36.4，72.2，57.3，209.6，75.4，135.4，143.3，67.4，40.8，43.6，20.6，27.4，15.5，12.7，76.5，OBzC＝O166.3，131.3，128.6，130.2，133.1，OAc(CH3)20.6，(C＝O)170.4。
實(shí)施例3A.制備浸膏取2000g經(jīng)自然干燥至含水量為12重量％的的加拿大紅豆杉莖葉，粉碎成粒度為0.5～2毫米的粉末，另取12只250ml的滲漉桶，每只滲漉桶裝入50g樹(shù)粉，按圖1所示，以間歇的方式往第一只滲漉捅中加入150ml70％的丙酮溶液，滲漉液在流經(jīng)第一只滲漉捅后流入第二只滲漉桶，依次類(lèi)推，第一只滲漉桶中不斷加入150ml70％的丙酮溶液，直至第十二只滲漉桶滲漉完畢，收集第十二只滲漉桶的滲漉液直至達(dá)到150ml，然后往第二只滲漉桶中加入150ml70％的丙酮溶液，第一只滲漉桶卸料后加入50g干燥樹(shù)粉，將第十二只滲漉桶的第二次滲漉液加入第一只滲漉桶，再收集第一只滲漉桶的第一次滲漉液，達(dá)到150ml后停止向第二只滲漉桶加入丙酮溶液，往第三只滲漉桶中加入150ml 70％的丙酮溶液，第二只滲漉桶卸料后加入50g干燥樹(shù)粉，依次類(lèi)推。合并600g樹(shù)粉的濃滲漉液共計(jì)1800ml，減壓回收至氣相色譜無(wú)丙酮峰，加水稀釋至約500ml，以100ml 1，2-二氯乙烷萃取三次，水相以HPLC檢查基本無(wú)10-脫乙酰巴卡亭III的峰。減壓回收萃取液，得浸膏36g。
用上述方法測(cè)定浸膏中紫杉烷類(lèi)化合物的提取率，結(jié)果紫杉烷類(lèi)化合物的提取率為99％。該浸膏提取過(guò)程共耗時(shí)約8小時(shí)。
B.分離10-脫乙酰巴卡亭III對(duì)30克步驟A所得浸膏溶解在乙酸乙酯溶劑中進(jìn)行硅膠柱層析，使用的硅膠購(gòu)自山東芝罘硅膠廠，用3∶1的正戊烷-乙酸丁酯預(yù)洗脫，再用乙酸甲酯洗脫，收集含10-脫乙酰巴卡亭III的部分，回收溶劑得到含10-脫乙酰巴卡亭III的干浸膏。
以1.8重量向所述干浸膏中加入乙酸乙酯，攪拌后過(guò)濾，得到10-脫乙酰巴卡亭III的粗品。
將得到的粗品用3∶1的正戊烷-乙酸丁酯洗滌，得到0.48g白色粉末，NMR確認(rèn)其為10-脫乙酰巴卡亭III的干浸膏，產(chǎn)品純度為96％，提取率為99％。
1H-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ16～19CH31.63(3H，S)，1.42(3H，S)，2.42(3H，S)，2.15(3H，S)；OAc(CH3)2.23(3H，S)。
13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ(1～20)78.3，76.0，48.1，81.2，84.6，36.4，72.2，57.3，209.6，75.4，135.4，143.3，67.4，40.8，43.6，20.6，27.4，15.5，12.7，76.5，OBzC＝O166.3，131.3，128.6，130.2，133.1，OAc(CH3)20.6，(C＝O)170.4。
實(shí)施例4A.制備浸膏用與實(shí)施例1相同的方法連續(xù)滲漉紅豆杉枝葉粉，但是使用90％乙醚作為浸提液，使用1，1-二氯乙烷作為萃取劑，結(jié)果紫杉烷類(lèi)化合物的提取率為98.5％。該浸膏提取過(guò)程共耗時(shí)約8.5小時(shí)。
B.分離10-脫乙酰巴卡亭III用與實(shí)施例1相同方法1分離10-脫乙酰巴卡亭III，但是使用2∶1的石油醚-乙酸丁酯預(yù)洗脫，使用干浸膏重量1.5倍的乙腈進(jìn)行溶解以除去雜質(zhì)，并使用2∶1的石油醚-乙酸丁酯洗滌，得到0.45g產(chǎn)品，提取率為98.5％，產(chǎn)品純度為99.2％，NMR確認(rèn)其為10-脫乙酰巴卡亭III1H-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ16～19CH31.63(3H，S)，1.42(3H，S)，2.42(3H，S)，2.15(3H，S)；OAc(CH3)2.23(3H，S)。
13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ(1～20)78.3，76.0，48.1，81.2，84.6，36.4，72.2，57.3，209.6，75.4，135.4，143.3，67.4，40.8，43.6，20.6，27.4，15.5，12.7，76.5，OBzC＝O166.3，131.3，128.6，130.2，133.1，OAc(CH3)20.6，(C＝O)170.4。
實(shí)施例5A.制備浸膏用與實(shí)施例1相同的方法連續(xù)滲漉紅豆杉枝葉粉，但是使用乙酸乙酯作為浸提液，使用二氯甲烷作為萃取劑，結(jié)果紫杉烷類(lèi)化合物的提取率為98.0％。該浸膏提取過(guò)程共耗時(shí)約9小時(shí)。
B.分離10-脫乙酰巴卡亭III用與實(shí)施例2相同方法1分離10-脫乙酰巴卡亭III，但是使用3.5∶1的正丁烷-乙酸丙酯預(yù)洗脫，產(chǎn)品用3.5∶1的正丁烷-乙酸丙酯洗滌，使用NMR確認(rèn)其為10-脫乙酰巴卡亭III，提取率為99％，產(chǎn)品純度為98.5％。
1H-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ16～19CH31.63(3H，S)，1.42(3H，S)，2.42(3H，S)，2.15(3H，S)；OAc(CH3)2.23(3H，S)。
13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ(1～20)78.3，76.0，48.1，81.2，84.6，36.4，72.2，57.3，209.6，75.4，135.4，143.3，67.4，40.8，43.6，20.6，27.4，15.5，12.7，76.5，OBzC＝O166.3，131.3，128.6，130.2，133.1，OAc(CH3)20.6，(C＝O)170.4。
實(shí)施例6A.制備浸膏用與實(shí)施例1相同的方法連續(xù)滲漉紅豆杉枝葉粉，但是使用98％甲基乙基醚水溶液作為浸提液，使用氯乙烷作為萃取劑，結(jié)果紫杉烷類(lèi)化合物的提取率為98.0％。該浸膏提取過(guò)程共耗時(shí)約9小時(shí)。
B.分離10-脫乙酰巴卡亭III用與實(shí)施例4相同方法分離10-脫乙酰巴卡亭III，但是使用3.1∶1的正己烷-乙酸乙酯預(yù)洗脫，產(chǎn)品用3.1∶1的正己烷-乙酸乙酯洗滌，得到的產(chǎn)品用NMR確認(rèn)其為10-脫乙酰巴卡亭III，提取率為98.8％，產(chǎn)品純度為97％。
1H-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ16～19CH31.63(3H，S)，1.42(3H，S)，2.42(3H，S)，2.15(3H，S)；OAc(CH3)2.23(3H，S)。
13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ(1～20)78.3，76.0，48.1，81.2，84.6，36.4，72.2，57.3，209.6，75.4，135.4，143.3，67.4，40.8，43.6，20.6，27.4，15.5，12.7，76.5，OBzC＝O166.3，131.3，128.6，130.2，133.1，OAc(CH3)20.6，(C＝O)170.4。
實(shí)施例7A.制備浸膏用與實(shí)施例1相同的方法連續(xù)滲漉紅豆杉枝葉粉，但是使用98％甲乙酮作為浸提液，使用1，1-二氯乙烷作為萃取劑，結(jié)果紫杉烷類(lèi)化合物的提取率為98.5％。該浸膏提取過(guò)程共耗時(shí)約8.5小時(shí)。
B.分離10-脫乙酰巴卡亭III用與實(shí)施例2相同方法1分離10-脫乙酰巴卡亭III，但是使用3.2∶1的正戊烷-乙酸戊酯預(yù)洗脫，產(chǎn)品用3.2∶1的正戊烷-乙酸戊酯洗滌，得到的產(chǎn)品用NMR確認(rèn)其為10-脫乙酰巴卡亭III，提取率為99％，純度為97.5％。
1H-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ16～19CH31.63(3H，S)，1.42(3H，S)，2.42(3H，S)，2.15(3H，S)；OAc(CH3)2.23(3H，S)。
13C-NMR數(shù)據(jù)(CDCl3)δ(1～20)78.3，76.0，48.1，81.2，84.6，36.4，72.2，57.3，209.6，75.4，135.4，143.3，67.4，40.8，43.6，20.6，27.4，15.5，12.7，76.5，OBzC＝O166.3，131.3，128.6，130.2，133.1，OAc(CH3)20.6，(C＝O)170.4。
由上面描述可見(jiàn)，以實(shí)施例1和比較例1為例，用本發(fā)明方法從500g樹(shù)粉中提取紫杉烷類(lèi)化合物約需1000mL 95％的乙醇，提取時(shí)間約需8小時(shí)；如果按傳統(tǒng)浸提法操作，則需95％的乙醇16000mL，提取時(shí)間為20小時(shí)。即其溶劑用量為本發(fā)明方法的16倍。因此，與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明方法可顯著提高浸提效率，減少溶劑用量，有助于降低成本并減輕對(duì)環(huán)境的壓力。
另外，使用本發(fā)明方法，10-脫乙酰巴卡亭III的提取效率最高可達(dá)99.2％，這是現(xiàn)有技術(shù)未提到的。因此，使用本發(fā)明提取方法取得了良好的效果。
權(quán)利要求
1.一種從紅豆杉中提取10-脫乙酰巴卡亭III的方法，它依次包括如下步驟用多級(jí)連續(xù)滲漉提取法用有機(jī)浸提液對(duì)紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提，得到含紫杉烷類(lèi)化合物的有機(jī)浸提溶液；對(duì)得到的有機(jī)液進(jìn)行硅膠柱層析，以乙酸C1-C6烷酯洗脫，得到10-脫乙酰巴卡亭III；除去溶劑后得到干浸膏，加入所述干浸膏重量1.5-2.2倍的乙酸C1-C6烷酯或乙腈溶解除去雜質(zhì)，得到10-脫乙酰巴卡亭III。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在洗脫前用4∶1-1∶1的C4-C8烷烴-乙酸C1-C6烷酯或者以4∶1-1∶1石油醚-乙酸C1-C6烷酯預(yù)洗脫以除去雜質(zhì)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于在得到含紫杉烷類(lèi)化合物的有機(jī)浸提液以后，但是進(jìn)行硅膠柱層析以前，它還依次包括如下步驟除去有機(jī)浸提溶液中的有機(jī)溶劑，得到水性浸提溶液；用極性有機(jī)溶劑對(duì)所述水性浸提溶液進(jìn)行萃取，得到有機(jī)萃取液；除去萃取液中的有機(jī)溶劑，得到含所述紫杉烷類(lèi)化合物的浸膏；用有機(jī)溶劑溶解該浸膏形成有機(jī)液。
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有機(jī)浸提液選自C1-4脂肪醇或其50-100％水溶液；丙酮或其50-100％水溶液、甲乙酮或其50-100％水溶液、乙醚或其50-100％水溶液、甲基乙基醚或其50-100％水溶液、乙酸C1-4烷酯。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于用于萃取的有機(jī)極性溶劑選自氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、氯乙烷，1，1-二氯乙烷或1，2-二氯乙烷。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述多級(jí)連續(xù)滲漉提取法為4-15級(jí)，所述有機(jī)浸提液為50-100％乙醇，并且所述用于萃取的有機(jī)極性溶劑為三氯甲烷。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于紅豆枝葉原料平均放置在各個(gè)滲漉段，當(dāng)流經(jīng)最后一級(jí)滲漉段而收集得到的浸提液以毫升為單位的體積達(dá)到平均每一個(gè)滲漉段所含紅豆杉枝葉以克為單位的重量的1-3倍時(shí)，停止向第一級(jí)滲漉段加入提取液，并在最后一級(jí)再增加一個(gè)滲漉段，隨后向第二級(jí)滲漉段加入提取液。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于當(dāng)流經(jīng)最后一級(jí)滲漉段而收集得到的浸提液以毫升為單位的體積達(dá)到平均每一個(gè)滲漉段所含紅豆杉枝葉以克為單位的重量的2倍時(shí)，停止向第一級(jí)滲漉段加入提取液，并在最后一級(jí)再增加一個(gè)滲漉段，隨后向第二級(jí)滲漉段加入提取液。
9.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于用于洗脫的溶劑是乙酸乙酯，該方法還包括用體積比為4∶1-1∶1的C4-C8烷烴-乙酸C1-C6烷酯或者4∶1-1∶1(v/v)的石油醚-乙酸C1-C6烷酯洗滌的步驟。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述用于溶劑處理的溶劑是乙酸乙酯。
全文摘要
一種從紅豆杉中提取10－脫乙酰巴卡亭III的方法，它依次包括如下步驟用多級(jí)連續(xù)滲漉提取法用有機(jī)浸提液對(duì)紅豆杉枝葉進(jìn)行浸提，得到含紫杉烷類(lèi)化合物的有機(jī)浸提溶液；對(duì)得到的有機(jī)液進(jìn)行硅膠柱層析，以4∶1－1∶1的C
文檔編號(hào)C07D305/00GK1616441SQ20041005417
公開(kāi)日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2004年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月1日
發(fā)明者魏紅, 徐從立, 許付, 周長(zhǎng)江 申請(qǐng)人:魏紅