專利名稱：一種提純制備三磷酸核苷衍生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核甘酸衍生物的提純方法，特別涉及一種提純制備三磷酸核苷衍生物的方法。
背景技術(shù)：
核苷酸是可解離化合物，其主體是陰離子，所以常用717、201等陰離子交換樹(shù)脂或DEAE-Sephadex等弱堿性陰離子交換樹(shù)脂加以分離提純。
對(duì)于人工合成的核苷酸衍生物，通常也用相應(yīng)陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行分離提純。
文獻(xiàn)(J.Med.Chem.1999，42213)報(bào)道，在下面的單磷酸核苷衍生物和二氯磷酸衍生物反應(yīng)中 目標(biāo)產(chǎn)物是三磷酸核苷衍生物。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)含目標(biāo)產(chǎn)物三磷酸核苷衍生物的反應(yīng)處理液采用DEAE-Sephadex陰離子交換樹(shù)脂，以三乙胺的碳酸氫鹽或碳酸氫銨水溶液作為洗脫液進(jìn)行分離提純，得到的三磷酸核苷銨鹽如易吸潮，用碘化鈉的丙酮溶液將其轉(zhuǎn)化成鈉鹽。結(jié)果是，目標(biāo)產(chǎn)物三磷酸核苷衍生物的提純制備收率很低，通常只有8％左右。
造成這種情況的主要原因是，未反應(yīng)的原料單磷酸核苷衍生物與目標(biāo)產(chǎn)物三磷酸核苷衍生物，單用陰離子交換樹(shù)脂不能得到有效徹底分離，原料和產(chǎn)物形成的交叉餾分很多，含純產(chǎn)物的餾分很少，因而損失很大。即使將交叉餾分再進(jìn)行一次陰離子交換樹(shù)脂分離，收效甚微，原料和產(chǎn)物仍不能得到徹底有效分離。另外，用碘化鈉的丙酮溶液將由陰離子交換樹(shù)脂分離得到的易吸潮的純?nèi)姿岷塑昭苌镤@鹽轉(zhuǎn)化成鈉鹽的過(guò)程中，轉(zhuǎn)化率不高，結(jié)晶析出時(shí)又大打折扣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是提高合成型三磷酸核苷衍生物的純化收率；優(yōu)化制備型三磷酸核苷衍生物的提純方法。
本發(fā)明的思路是本發(fā)明將用陰離子交換樹(shù)脂分離得到的所有含產(chǎn)物的混合交叉部分合并，再用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行離子交換，可以徹底截住未反應(yīng)的原料單磷酸核苷衍生物，而目標(biāo)產(chǎn)物三磷酸核苷衍生物則在樹(shù)脂上被交換成原酸型無(wú)損耗地流淌下來(lái)，如有必要可將提純后的三磷酸核苷衍生物的銨鹽直接用碳酸氫鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的三磷酸腺苷鹽。
本發(fā)明技術(shù)方案是一種提純制備三磷酸核苷衍生物的方法，單磷酸核苷衍生物和二氯磷酸衍生物反應(yīng)得到含有目標(biāo)產(chǎn)物三磷酸核苷衍生物的反應(yīng)處理液，用陰離子交換樹(shù)脂按常規(guī)方法提純得到的含單磷酸核苷和三磷酸核苷混合餾分，其特征在于用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)含單磷酸核苷和三磷酸核苷混合餾分進(jìn)行徹底分離純化，得到提純的三磷酸核苷衍生物，必要時(shí)用碳酸氫鹽直接制成相應(yīng)的三磷酸核苷鹽。
本發(fā)明所涉及的強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為Dowex 50wx及相應(yīng)型號(hào)強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂，對(duì)于所分離純化的分子長(zhǎng)度大于20A的三磷酸核苷衍生物，最好用Dowex 50wx大孔徑的D001或相應(yīng)型號(hào)強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂。
本發(fā)明所涉及的碳酸氫鹽是碳酸氫鈉或碳酸氫鉀。
本發(fā)明所涉及的三磷酸核苷衍生物通式為 上式中B為嘌呤類或嘧啶類堿基，也可以為其它含氮雜環(huán)。
P為由三個(gè)磷原子組成的基團(tuán)，相鄰兩個(gè)磷原子間除以氧原子構(gòu)成磷酸酐形式外，也可以通過(guò)其它原子相連。
實(shí)施本發(fā)明前，先要把反應(yīng)做好，反應(yīng)結(jié)束后用過(guò)濾方法，將反應(yīng)液中的不溶性雜質(zhì)除去，抽干有機(jī)溶劑，用水溶解，上陰離子交換樹(shù)脂，水洗，接著用梯度濃度有機(jī)胺的碳酸氫鹽或碳酸氫銨溶液，以洗去無(wú)機(jī)物和有機(jī)質(zhì)，合并含有產(chǎn)物的餾分。
實(shí)施本發(fā)明是很簡(jiǎn)單的，先將強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂轉(zhuǎn)化成H+型，再將含有產(chǎn)物和原料的混合交叉部分合并，上樣，原料單磷酸核苷被截留在樹(shù)脂上，而產(chǎn)物三磷酸核苷的陽(yáng)離子被樹(shù)脂上的H+交換后以酸的形式流淌到含有碳酸氫銨的容器內(nèi)，重新形成銨鹽，完成了一個(gè)凈化過(guò)程。經(jīng)高真空冷凍干燥機(jī)干燥，多余的碳酸氫銨被徹底除去，得到的是純凈的目標(biāo)產(chǎn)物銨鹽。
如得到的衍生物銨鹽純品易吸潮，按照本發(fā)明，可用準(zhǔn)確當(dāng)量的碳酸氫鈉或碳酸氫鉀將其直接轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的鈉鹽或鉀鹽
(注ATP表示三磷酸核苷衍生物)本發(fā)明的有益效果是采用本發(fā)明方法，目標(biāo)產(chǎn)物三磷酸核苷衍生物的提純制備收率比已知文獻(xiàn)方法提高6倍以上。


圖1為實(shí)例1陰離子交換樹(shù)脂分離后三磷酸核苷銨鹽1H-NMR譜2為實(shí)例1陰離子交換樹(shù)脂分離后三磷酸核苷銨鹽31P-NMR譜3為實(shí)例1陰離子交換樹(shù)脂分離后不純物1H-NMR譜4為實(shí)例1陰離子交換樹(shù)脂分離后不純物31P-NMR譜5為實(shí)例1陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離后三磷酸核苷銨鹽1H-NMR譜6為實(shí)例1陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離后三磷酸核苷銨鹽31P-NMR譜7為實(shí)例1三磷酸核苷鈉鹽1H-NMR譜8為實(shí)例1三磷酸核苷鈉鹽31P-NMR譜9為實(shí)例2陰離子交換樹(shù)脂分離后粗品1H-NMR譜10為實(shí)例2陰離子交換樹(shù)脂分離后粗品31P-NMR譜11為實(shí)例2陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離后回收單磷酸核苷1H-NMR譜12為實(shí)例2陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離后回收單磷酸核苷31P-NMR譜13為實(shí)例2陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離后三磷酸核苷銨鹽1H-NMR譜14為實(shí)例2陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離后三磷酸核苷銨鹽31P-NMR譜15為實(shí)例2三磷酸核苷鈉鹽1H-NMR譜16為實(shí)例3陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離后三磷酸核苷銨鹽31P-NMR譜圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1反應(yīng)式 將185毫克三正丁胺溶于15毫升吡啶中，加583毫克單磷酸核苷銨鹽，攪拌溶解后于40℃下高真空抽干，氮?dú)庀陆獬婵铡＜?2毫升無(wú)水DMF，溶解后加810毫克CDI，攪拌過(guò)夜。加246毫克甲醇，攪拌一小時(shí)后滴加1392毫克二氯磷酸和1056毫克三正丁胺溶于35毫升DMF的溶液，室溫下攪拌反應(yīng)26小時(shí)，過(guò)濾，60℃以下高真空抽去DMF，加20毫升去離子水，上陰離子交換樹(shù)脂DEAD-Sephadex A-100柱進(jìn)行分離。用500毫升去離子水洗，接著用250毫升0.1M碳酸氫銨和250毫升0.2M碳酸氫銨洗去未反應(yīng)完的二氯磷酸，最后用0.3M的碳酸氫銨洗脫。洗脫過(guò)程中，用UV監(jiān)測(cè)產(chǎn)物是否流出，一旦流出，每25毫升為一份。冷凍后，分別置真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，以H1-NMR和P31-NMR檢測(cè)，合并相同部分。得純產(chǎn)物三磷酸核苷銨鹽35毫克，收率3.89％，見(jiàn)譜圖1(1H-NMR)和譜圖2(31P-NMR)；另得474毫克不純物，見(jiàn)譜圖3(1H-NMR)和譜圖4(31P-NMR)，從磷譜看，約含14％(mol/mol)未反應(yīng)完的單磷酸核苷銨鹽(δ3.495單峰)。
取預(yù)先處理好的20克大孔強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂D001(H+型)裝入柱子，將上述得到的474毫克白色粉末溶于50毫升去離子水中，上樣，控制流量緩慢流出，餾分呈酸性并有UV吸收時(shí)，表明產(chǎn)物三磷酸核苷已餾出。含有產(chǎn)物的餾出液直接流入盛有320毫克碳酸氫銨的容器內(nèi)。當(dāng)樣品液面降到樹(shù)脂頂部時(shí)，繼續(xù)用水洗，至餾出液呈中性或無(wú)UV時(shí)，表明產(chǎn)物已餾完。單磷酸核苷留在樹(shù)脂內(nèi)，而三磷酸核苷銨鹽同H+型的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂發(fā)生離子交換后以原酸型餾出，餾出后又與碳酸氫銨作用形成銨鹽。餾出液冷凍后，置真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，多余的碳酸氫銨升華飴盡。得純?nèi)姿岷塑珍@鹽403毫克，連同用陰離子交換樹(shù)脂DEAD-Sephadex A-100進(jìn)行分離得到的35毫克純?nèi)姿岷塑珍@鹽，共438毫克，收率49.29％，從譜圖5(1H-NMR)和譜圖6(31P-NMR)上可以看出，已無(wú)單磷酸核苷痕跡。
得到的三磷酸核苷衍生物銨鹽易吸潮，可用等當(dāng)量碳酸氫鈉將其轉(zhuǎn)化成鈉鹽將得到的純?nèi)姿岷塑珍@鹽438毫克(0.497mmol)溶入含有125毫克碳酸氫鈉(1.491mmol)10毫升純凈水的溶液中，冷凍后置真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，得445毫克純?nèi)姿岷塑这c鹽白色粉末。見(jiàn)譜圖7(1H-NMR)和譜圖8(31P-NMR)。
實(shí)例2將徹底干燥的2006毫克單磷酸核苷銨鹽溶入10毫升無(wú)水吡啶中，加665毫克三正丁胺，溶解后減壓抽干，之后繼續(xù)用油泵將水分徹底抽干，用氮?dú)饨獬婵?。?5毫升絕對(duì)無(wú)水DMF，溶解后加2718毫克CDI。攪拌14小時(shí)加936毫克無(wú)水甲醇。兩小時(shí)后滴加4893毫克二氯磷酸和3694毫克三正丁胺溶入120毫升絕對(duì)無(wú)水DMF的溶液，室溫下攪拌反應(yīng)24小時(shí)。過(guò)濾，油泵抽干DMF，加100毫升去離子水，用弱堿性陰離子交換樹(shù)脂DEAD-Sephadex A-50柱進(jìn)行分離。先用2000毫升去離子水洗，再用1000毫升0.1M碳酸氫銨和1000毫升0.2M碳酸氫銨洗，以洗去未反應(yīng)完的二氯磷酸，最后用0.3M的碳酸氫銨洗脫。洗脫過(guò)程中，用UV檢查產(chǎn)物是否流出，將含有產(chǎn)物的餾分冷凍后，置真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，共2089毫克粗品，從圖譜9(1H-NMR)和圖譜10(31P-NMR)看，顯示有單磷酸核苷存在，含有約18％(mol/mol)的單磷酸核苷(31P-NMR)。
將上述白色粉末粗品溶入200毫升去離子水中，另取預(yù)先處理成H+型的100克大孔強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂D001裝入柱子。上樣，控制流量緩慢流出，通過(guò)UV監(jiān)視產(chǎn)物三磷酸核苷是否餾出，將餾出液直接流入盛有2000毫克碳酸氫銨的容器內(nèi)，繼續(xù)用去離子水洗，直至無(wú)產(chǎn)物餾出。(產(chǎn)物餾完，單磷酸核苷還留在樹(shù)脂內(nèi)，改用2M的氨水洗脫，將含有單磷酸核苷的餾分冷凍后真空冷凍干燥，回收到382毫克原料單磷酸核苷，見(jiàn)圖譜111H-NMR和圖譜1231P-NMR)。將含有產(chǎn)物三磷酸核苷的餾出液冷凍后，置真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，得純?nèi)姿岷塑珍@鹽1622毫克，收率53.45％。見(jiàn)圖譜13(1H-NMR)和圖譜14(31P-NMR)。將上述純凈的三磷酸核苷銨鹽溶入含有463毫克碳酸氫鈉的50毫升純凈水中，冷凍后置真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，得1650毫克白色磷酸核苷鈉鹽。見(jiàn)圖譜15(1H-NMR)。元素分析C17H22Cl2F3N5Na3O12P3S2·4H2O，912.94，C計(jì)算值22.33％，實(shí)驗(yàn)值22.66％。
實(shí)例3反應(yīng)式 在20毫升無(wú)水吡啶中加入2.62克單磷酸核苷銨鹽和1.3克三正丁胺，攪拌溶解后于40℃下高真空抽干，氮?dú)庀陆獬婵?。?0毫升無(wú)水DMF和5.44克CDI。攪拌過(guò)夜加1.88克無(wú)水甲醇。攪拌下滴加9.8克二氯磷酸和7.4克三正丁胺溶入240毫升無(wú)水DMF的溶液，室溫下攪拌反應(yīng)一天。濾除白色固體，用油泵抽去DMF，加200毫升去離子水，攪拌后倒入弱堿性陰離子交換樹(shù)脂DEAD-Sephadex A-50柱，進(jìn)行分離，用4000毫升去離子水洗，再分別用2000毫升0.1M碳酸氫銨和2000毫升0.2M碳酸氫銨洗，然后用0.3M的碳酸氫銨洗。UV監(jiān)測(cè)洗脫過(guò)程，將含有產(chǎn)物的餾分冷凍后，置真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，得3250毫克粗品。將此白色粉末粗品溶入300毫升去離子水中。另取預(yù)先處理成H+型的200克大孔強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂D001裝入柱子。上樣，控制流出速度，用UV監(jiān)視產(chǎn)物三磷酸核苷是否餾出，將餾出液直接流入盛有4000毫克碳酸氫銨的容器內(nèi)，繼續(xù)用去離子水洗，直至無(wú)產(chǎn)物餾出。將含有產(chǎn)物三磷酸核苷的餾出液冷凍后，置真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)干燥，得純?nèi)姿岷塑珍@鹽白色粉末2520毫克，收率58.79％。見(jiàn)圖譜16(31P-NMR)。
元素分析C11H25Cl2N8O12P3·4H2O，696.06，C計(jì)算值18.95％，實(shí)驗(yàn)值19.02％；H計(jì)算值4.77％，實(shí)驗(yàn)值4.72％。
權(quán)利要求
1.一種提純制備三磷酸核苷衍生物的方法，單磷酸核苷衍生物和二氯磷酸衍生物反應(yīng)得到含有目標(biāo)產(chǎn)物三磷酸核苷衍生物的反應(yīng)處理液，用陰離子交換樹(shù)脂按常規(guī)方法提純得到的含單磷酸核苷和三磷酸核苷混合餾分，其特征在于用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)含單磷酸核苷和三磷酸核苷混合餾分進(jìn)行徹底分離純化，得到提純的三磷酸核苷衍生物，必要時(shí)用碳酸氫鹽直接制成相應(yīng)的三磷酸核苷鹽。
2.按照權(quán)利要求1所描述的方法，其特征在于所涉及的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂最好用Dowex 50wx及相應(yīng)型號(hào)強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂。
3.按照權(quán)利要求1或2所描述的方法，其特征在于對(duì)于所分離純化的分子長(zhǎng)度大于20A的三磷酸核苷衍生物，最好用Dowex 50wx大孔徑的D001或相應(yīng)型號(hào)強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂。
4.按照權(quán)利要求1所描述的方法，其特征在于碳酸氫鹽為碳酸氫鈉或碳酸氫鉀。
5.按照權(quán)利要求1所描述的方法，其特征在于用提純后的三磷酸核苷衍生物的銨鹽加等當(dāng)量的碳酸氫鈉或碳酸氫鉀，共溶于水，經(jīng)真空冷凍干燥后制成不易潮解的相應(yīng)鈉鹽或鉀鹽。
6.按照權(quán)利要求1所描述的方法，其特征在于所涉及的三磷酸核苷衍生物是指 上式中B為嘌呤類或嘧啶類堿基，也可以為其它含氮雜環(huán)；P為由三個(gè)磷原子組成的基團(tuán)，相鄰兩個(gè)磷原子間除以氧原子構(gòu)成磷酸酐形式外，也可以通過(guò)其它原子相連。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核甘酸衍生物的提純方法，特別涉及一種提純制備三磷酸核苷衍生物的方法。解決了現(xiàn)有利用陰離子交換樹(shù)脂或DEAE－Sephadex等弱堿性陰離子交換樹(shù)脂分離提純?nèi)姿岷塑昭苌锎嬖诘奶峒兊寐实偷娜毕?。一種提純制備三磷酸核苷衍生物的方法，單磷酸核苷衍生物和二氯磷酸衍生物反應(yīng)得到含有目標(biāo)產(chǎn)物三磷酸核苷衍生物的反應(yīng)處理液，用陰離子交換樹(shù)脂按常規(guī)方法提純得到的含單磷酸核苷和三磷酸核苷混合餾分，其特征在于用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)含單磷酸核苷和三磷酸核苷混合餾分進(jìn)行徹底分離純化，得到提純的三磷酸核苷衍生物，必要時(shí)用碳酸氫鹽直接制成相應(yīng)的三磷酸核苷鹽。主要用于三磷酸核苷衍生物的提純制備。采用本發(fā)明方法，目標(biāo)產(chǎn)物三磷酸核苷衍生物的提純制備收率比已知文獻(xiàn)方法提高6倍以上。
文檔編號(hào)C07H19/20GK1613864SQ20031010833
公開(kāi)日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2003年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月3日
發(fā)明者徐繼有, 陳華祥, 馬汝建, 李革 申請(qǐng)人:上海藥明康德新藥開(kāi)發(fā)有限公司