治療性蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放儲(chǔ)槽式調(diào)配物和其用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其包括治療性蛋白質(zhì)。所述治療性蛋白質(zhì)可以是基于毒素的治療性蛋白質(zhì)。所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在持續(xù)有效含量?jī)?nèi)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。所述基于毒素的治療性蛋白質(zhì)可包括基于ShK的蛋白質(zhì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
治療性蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放儲(chǔ)槽式調(diào)配物和其用途
[0001 ] 相關(guān)申請(qǐng)案的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)案要求2013年12月23日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)案第61/920,383號(hào)的優(yōu) 先權(quán)和權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及用于持續(xù)釋放治療性蛋白質(zhì)的調(diào)配物，其包括具有至少一個(gè)二硫橋鍵 的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)。也披露產(chǎn)生和使用所述調(diào)配物的方法。在單次投予后，調(diào)配物 在受試者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)持續(xù)有效含量的治療性蛋白質(zhì)維持至少一個(gè)月。
【背景技術(shù)】
[0004] -般來(lái)說(shuō)，治療性藥品具有介于最小有效劑量與最大容許劑量之間的可接受有效 含量的范圍，稱(chēng)為藥品的治療窗。維持藥品在治療窗內(nèi)需要不超過(guò)最大容許劑量的持續(xù)有 效含量的藥物。
[0005] 在治療性蛋白質(zhì)的情況下，通常通過(guò)頻繁非經(jīng)腸注射實(shí)現(xiàn)不超過(guò)最大容許劑量的 持續(xù)有效含量。然而，頻繁注射的需求是不方便的，可能導(dǎo)致受試者順應(yīng)性不佳，并且可能 引起受試者體內(nèi)治療性蛋白質(zhì)的波動(dòng)和潛在有害的含量。
[0006] 多次注射的替代方法利用調(diào)節(jié)治療性蛋白質(zhì)在投予至受試者之后隨時(shí)間釋放的 可生物降解材料。通過(guò)相互作用導(dǎo)致治療性蛋白質(zhì)控制緩慢釋放的分子排列的封裝和形成 方法，理論上可實(shí)現(xiàn)持續(xù)升高的蛋白質(zhì)含量。盡管所述方法理論上運(yùn)作良好，但已發(fā)現(xiàn)此類(lèi) 釋放系統(tǒng)通常顯示稱(chēng)為"爆發(fā)"的極高初始釋放速率，使大量治療性蛋白質(zhì)在投予之后快速 釋出。這一爆發(fā)可能形成超過(guò)治療窗的蛋白質(zhì)濃度，通常導(dǎo)致非所要副作用并且釋放系統(tǒng) 中隨后留下不足以支撐稍后的有效含量的量。另外，此類(lèi)組合物通常在血液濃度中產(chǎn)生非 所要峰值和谷值，導(dǎo)致治療含量隨時(shí)間不一致。
[0007] 例如生理學(xué)溫度、生物分子的環(huán)境和對(duì)投予控制釋放組合物的免疫反應(yīng)等因素可 能會(huì)通過(guò)例如分解和聚集等造成生物可用性差的機(jī)制不利地改變治療性蛋白質(zhì)的處置。這 些自然過(guò)程可能會(huì)干擾組合物的所要釋放曲線和效用，尤其因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是具有許多限定分 解和消除路徑的本質(zhì)上不穩(wěn)定分子。
[0008] 已成功地形成包括例如亮丙立德（leuprolide)(和相關(guān)化合物，包括布舍瑞林 (buserelin)、組氨瑞林(histrelin)、戈舍瑞林(goserelin)、那法瑞林(nafarelin)以及曲 普瑞林(tr iptore 11 in))的促性腺素釋放激素(GnRH)促效劑的控制釋放組合物，其展現(xiàn)在 投予之后1-3個(gè)月的持續(xù)釋放(美國(guó)專(zhuān)利第5，980，945號(hào);第6，036，976號(hào);第6，337，618號(hào)）。 黃體生成素釋放激素(LH-RH)促效劑也已經(jīng)組合到控制釋放組合物中（美國(guó)專(zhuān)利第3,853， 837 號(hào)、第4,008,209 號(hào)、第3,972,859 號(hào)、第4,086,219 號(hào)、第4,124,577 號(hào)、第4,253,997 號(hào)以 及第4，317,815號(hào)；英國(guó)專(zhuān)利第1423083號(hào)）。然而，這些調(diào)配物中的活性化合物極短（約9個(gè) 氨基酸)并且缺乏與治療性蛋白質(zhì)活性有關(guān)的高級(jí)結(jié)構(gòu)要素，例如二級(jí)結(jié)構(gòu)要素(例如a_螺 旋和薄片）以及三級(jí)結(jié)構(gòu)要素。舉例來(lái)說(shuō)，NMR結(jié)構(gòu)已表明一個(gè)I型或II型0轉(zhuǎn)角。另外，看 起來(lái)并非這些單個(gè)直鏈類(lèi)似物形式的化合物的治療功效所必需的結(jié)構(gòu)組分顯示針對(duì)例如 MCF-7乳癌細(xì)胞系的相關(guān)目標(biāo)的強(qiáng)效活性。
[0009] 已經(jīng)進(jìn)行大量工作來(lái)嘗試解決與產(chǎn)生更復(fù)雜治療性蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放儲(chǔ)槽式調(diào) 配物有關(guān)的問(wèn)題（參看例如艾利森(Aliison)，藥物傳遞的專(zhuān)業(yè)觀點(diǎn)（Expert Opin.Drug 〇61:^.)5:615-28,2008;徐（父11)等人，藥學(xué)學(xué)報(bào)（厶(^&?11&1'1]1&。6111:;[。&3;[11；[。&)，42:1-7， 2007 ;榮格（Jung)等人，國(guó)際藥學(xué)研究（Arch. Pharm. Res. ) 32: 359-65,2009;波伊索 (Bouissou)等人，藥學(xué)研究(Pharm. Res ? )23:1295-305，2006;盧安(Luan)等人，歐洲藥劑學(xué) 和生物藥劑學(xué)期刊(Eur ? J ? Pharm ? Biopharm ?) 63:205-14，2006;鄧肯(Duncan)等人，控制釋 放期刊（J.Control Release)110:34_48,2005;利奇（Leach)等人，醫(yī)藥科學(xué)期刊 (J.Pharm.Sci. )94:56-69,2005;楊(￥60)等人，國(guó)際藥學(xué)研究27:1-12,2004;葉（丫611)等人， 微膠囊期刊（J.Microencapsul ?)24:82-93，2007;科斯坦蒂諾(Costantino)等人，醫(yī)藥科學(xué) 期刊93:2624-2634，2004;楊等人，國(guó)際藥學(xué)研究，27:1-12，2004;萍(Pean)等人，控制釋放 期刊56 :175-187，1998;美國(guó)專(zhuān)利第5,891，478號(hào)；卡拉斯基羅(0&^ &8卩111110)，控制釋放期 刊76:199-208,2001;卡斯特利亞諾斯（Castellanos)等人，醫(yī)藥藥理學(xué)期刊（J. Pharm Pharmacol )53:1099-1107,2001;李（Lee)等人，生物化學(xué)期刊（J. Biol. Chem. )256: 7193-7201，1981;佩雷斯(Perez.)等人，醫(yī)藥藥理學(xué)期刊54:301-313,2002;以及泰勒(Taylor)等 人，糖尿病(Diabetes)51(增刊2):A85,2002)。盡管這一領(lǐng)域中已有大量研究，然而，僅少數(shù) 肽成功地調(diào)配成控制釋放組合物。
[0010] 嘗試控制和降低蛋白質(zhì)釋放的初始爆發(fā)第先前實(shí)例大部分不成功并且包括:牛血 清白蛋白（1^八）（薩馬迪（3&1]1&(1;[)等人，生物大分子（13;[01]1&(31'〇111〇16(311168)14:1044-53 2013) ;a_胰凝乳蛋白酶(弗洛雷斯(Flores)-費(fèi)爾南德斯(Fern如dez)等人，結(jié)果醫(yī)藥科學(xué) (Results Pharma，Sci. )2: 46-51,2012);粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞菌落刺激因子（GM-CSF)(張 (Zhang)等人，微膠囊期刊（J.Microencapsul ?)28: 743-51,2011);干擾素a-2b(李（Li)等 人，國(guó)際藥學(xué)期刊（111^.?1^111.)410:48-53,2011) ;組織壞死因子€^即-€〇(金姆(燈111)等 人，控制釋放期刊150:63-9,2011);紅細(xì)胞生成素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子以及人類(lèi)生長(zhǎng)因子（耶 (Ye)等人，控制釋放期刊（J Control Release. )146:241-60,2010)以及人類(lèi)生長(zhǎng)激素（美 國(guó)專(zhuān)利第5,891，478號(hào)）。展現(xiàn)明顯早期爆發(fā)的調(diào)配物也已在例如鄭(Zheng)等人，藥物傳遞 (Drug Deliv.)17:77-82,2010中綜述。
[0011] 與實(shí)現(xiàn)治療性蛋白質(zhì)持續(xù)釋放有關(guān)的額外難題包括囊封蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性和/或 治療性蛋白質(zhì)從組合物的不完全釋放(葉等人，國(guó)際藥學(xué)研究，27:1-12,2004)。已嘗試許多 方法來(lái)解決這些問(wèn)題中的每一者，包括穩(wěn)定賦形劑（李等人，生物化學(xué)期刊，256:7193_ 7201，1981)、核-殼結(jié)構(gòu)（袁（Yuan)等人，國(guó)際納米醫(yī)學(xué)期刊（1]11:.]\似11〇1116(1;[0;[116)7:257-270，2012)以及活性組分的分子工程改造(盧克(Lucke)等人，藥物研究(Pharm. Res ?)，19: 175-181,2002)。盡管進(jìn)行了全部這些方法和嘗試，但治療性蛋白質(zhì)大部分未能成功調(diào)配成 持續(xù)釋放系統(tǒng)。參看例如帕伊（Pai)等人，AAPS J. 11(1) :88-98,2009年3月；PMCID: PMC2664882。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 需要投予無(wú)需多次注射就能實(shí)現(xiàn)有效含量的蛋白質(zhì)持續(xù)釋放形式的治療性蛋白 質(zhì)的能力。尤其需要投予比不具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的事先調(diào)配的短蛋白質(zhì)(例如GnRH促效劑或LH-RH)更復(fù)雜的治療性蛋白質(zhì)的能力。
[0013] 本發(fā)明通過(guò)提供持續(xù)釋放治療性蛋白質(zhì)（包括基于毒素的治療性蛋白質(zhì)）的調(diào)配 物解決這些需要。蛋白質(zhì)可包括至少一個(gè)二硫橋鍵。在單次投予之后，調(diào)配物提供持續(xù)有效 含量的治療性蛋白質(zhì)維持至少一個(gè)月。也披露產(chǎn)生和使用所述調(diào)配物的方法。
[0014] 具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供包括至少一種治療性蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放儲(chǔ)槽式調(diào)配物。更 具體來(lái)說(shuō)，持續(xù)釋放儲(chǔ)槽式調(diào)配物包括包含治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)部水相、包括可生物降解的 聚合物的第二相（油/固體相）以及分散有粒子的第三外部水相。內(nèi)部水相可以是特定化學(xué) 改性的微環(huán)境，其中選擇保留具體治療性蛋白質(zhì)的原生和活性構(gòu)形并且允許其與第二相聚 合物相容從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)隨時(shí)間持續(xù)釋放的pH、鹽濃度、溶劑、穩(wěn)定劑以及釋放改性劑。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為在37°C下使用機(jī)械攪拌將聚合物類(lèi)型PLG1A、PLG2A、PLG3A、PLG5E&&PLG7E (代表不同分子量和封端化學(xué)性質(zhì)的一定范圍的聚（丙交酯-共_乙交酯）（PLG))調(diào)配到2w/ v%十二烷基硫酸鈉(SDDS)介質(zhì)中的體外釋放曲線。
[0016] 圖2A和2B顯示如通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射所測(cè)量的三個(gè)獨(dú)立批次的PLG2A調(diào)配物的分散液 尺寸。圖2A示出了通過(guò)強(qiáng)度繪制的ShK-186持續(xù)釋放儲(chǔ)槽式調(diào)配物的尺寸分布；圖2B示出了 如通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射所測(cè)量的調(diào)配物中的粒子的體積加權(quán)分布。
[0017]圖3為負(fù)載治療性蛋白質(zhì)的PLG2A聚合物調(diào)配物的（電位(如通過(guò)電泳迀移率測(cè)量 的粒子表面電荷）的測(cè)量值。陰離子表面層幫助賦予水性懸浮液中的分散穩(wěn)定性乂電位測(cè) 量值顯示電荷為_(kāi)75、_72和-72mV的陰離子粒子的類(lèi)似緊湊簇，提供通過(guò)靜電排斥有助于膠 體穩(wěn)定性的庫(kù)侖相互作用。
[0018]圖4為調(diào)配物(PLG2A)的光學(xué)顯微圖像，顯示調(diào)配物內(nèi)粒子的形狀和大致均勻幾何 尺寸。所述圖顯示PLG聚合物囊封ShK-186的光學(xué)顯微(100X)圖像，顯示具有一微米尺寸的 圓形(可能球形)粒子。
[0019] 圖5A和5B顯示向史泊格-多利大鼠（Sprague-Dawley rat)單次皮下（SC)注射多種 調(diào)配物后，以40,000yg/kg給藥的ShK-186的體內(nèi)釋放速率。懸浮液使用PLG1A、PLG2A和 PLG3A制備。圖5A以線性標(biāo)度顯示這一數(shù)據(jù)，而圖5B提供對(duì)數(shù)(Log)標(biāo)度。
[0020] 圖6A和B為用PLG2A調(diào)配的不同劑量（高=40，000yg/kg，中等=20，000yg/kg，低= 10，000yg/kg)的ShK-186的體內(nèi)釋放的圖。保持史泊格-多利大鼠體內(nèi)ShK-186的血清含量 在相對(duì)窄濃度范圍上超過(guò)30天。圖6A顯示線性標(biāo)度。圖6B顯示對(duì)數(shù)標(biāo)度。
[0021] 圖7A和7B為單次SC注射之后，史泊格多利大鼠體內(nèi)以10,000yg/kg給藥的ShK-192 的體內(nèi)釋放圖。達(dá)到的最大濃度為幾乎t = 12天表明治療性蛋白質(zhì)從演進(jìn)PLG2A持續(xù)釋放儲(chǔ) 槽式調(diào)配物逐漸釋放，這是相對(duì)平穩(wěn)地持續(xù)30天的過(guò)程。圖7A顯示線性標(biāo)度。圖7B顯示對(duì)數(shù) 標(biāo)度。
[0022]圖8為針對(duì)PLG2A調(diào)配物的史泊格-多利大鼠體內(nèi)，以20,000yg/kg用一次SC注射給 藥的ShK-186的體內(nèi)釋放曲線，顯示t = 2天時(shí)的Cmax以及延伸56天的長(zhǎng)期持續(xù)釋放尾。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 多蛋白質(zhì)因?yàn)樵隗w內(nèi)展現(xiàn)生物活性而適用作治療性藥品。然而，嘗試使用這些蛋 白質(zhì)作為療法時(shí)，難以不頻繁注射投予就實(shí)現(xiàn)持續(xù)有效含量的蛋白質(zhì)。
[0024] 多次注射的替代方法為投予已囊封在調(diào)節(jié)治療性蛋白質(zhì)隨時(shí)間釋放的可生物降 解材料中的治療性蛋白質(zhì)。盡管這一方法理論上良好起作用，但已發(fā)現(xiàn)難以實(shí)現(xiàn)此類(lèi)控制 釋放組合物。舉例來(lái)說(shuō)，許多此類(lèi)控制釋放組合物顯示可能形成超過(guò)治療窗的藥物濃度的 爆發(fā)，由此增加非所需副作用的可能性，并且最后在組合物中留下不足以持續(xù)隨后有效含 量的量的治療性蛋白質(zhì)。例如生理學(xué)溫度、生物分子環(huán)境和對(duì)投予控制釋放組合物的免疫 反應(yīng)的因素也可能不利地改變治療性蛋白質(zhì)的處置。
[0025] 本文所披露的持續(xù)釋放儲(chǔ)槽式調(diào)配物克服前述嘗試的失敗，例如本文所引用的參 考文獻(xiàn)中所述的那些。本文所披露的調(diào)配物通過(guò)解除給藥(避免多次注射)和減少非所要副 作用可提高患者順應(yīng)性。
[0026] 在具體實(shí)施例中，本文所披露的調(diào)配物顯示最小爆發(fā)作用的釋放特征以及小于5 或小于3的(：_比_的比率。這些比率表明如使用結(jié)構(gòu)敏感生物分析體外和體內(nèi)測(cè)量，分子 結(jié)構(gòu)的協(xié)同方面、調(diào)配物相互作用和工藝的成功組合以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定治療性蛋白質(zhì)的相對(duì)均勻 釋放。已控制包括第二最大值相對(duì)于第一最大值的尺寸(三相組分，盧安等人，歐洲藥劑學(xué) 和生物藥劑學(xué)期刊.63: 205-14,2006)和谷值的深度的釋放曲線的特征來(lái)產(chǎn)生隨延伸時(shí)間 段(例如超過(guò)一個(gè)月并且高達(dá)至少56天）明顯穩(wěn)定的血清含量。因此，在單次投予后，本文所 披露的持續(xù)釋放儲(chǔ)槽式調(diào)配物實(shí)現(xiàn)治療性蛋白質(zhì)的適合釋放特征(例如幾乎零級(jí)釋放動(dòng)力 學(xué))超過(guò)一個(gè)月或更久的時(shí)間段。
[0027] "持續(xù)釋放"應(yīng)解釋為包括：（1)單次投予后在有效含量?jī)?nèi)釋放至少一個(gè)月；或（2) 在單次投予后，在C max比Of均比率不超過(guò)5或不超過(guò)3的有效含量?jī)?nèi)釋放至少一個(gè)月。"持續(xù)釋 放"也可以解釋為包括：（1)單次投予后在有效含量?jī)?nèi)釋放至少56天;或(2)在單次投予后， 在Cmax比_比率不超過(guò)5或不超過(guò)3的有效含量?jī)?nèi)釋放至少56天。
[0028] "有效含量"是在具體蛋白質(zhì)治療窗內(nèi)的實(shí)現(xiàn)預(yù)期防治性治療或治療性治療而不 形成不希望的副作用的那些含量。
[0029] "儲(chǔ)槽式調(diào)配物"包括在投予后提供治療性蛋白質(zhì)向周?chē)M織中的持續(xù)釋放的治 療性蛋白質(zhì)傳遞系統(tǒng)。
[0030] 通過(guò)在本文所披露的工藝中組合治療性蛋白質(zhì)和賦形劑實(shí)現(xiàn)所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物， 所述工藝在具體實(shí)施例中，形成微囊封可生物降解顆粒分散液。
[0031] 在具體實(shí)施例中，本發(fā)明包括包含至少一種治療性蛋白質(zhì)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物。更具 體來(lái)說(shuō)，儲(chǔ)槽式調(diào)配物可包括包含治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)部水相、包括聚合物的第二中間相 (油/固相;在具體實(shí)施例中，聚合物可生物降解），以及可分散粒子的第三外部水相。內(nèi)部水 相是特定化學(xué)改性的微環(huán)境，其中選擇保留具體治療性蛋白質(zhì)的原生和活性構(gòu)形并且允許 其與第二聚合物相容從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)隨時(shí)間持續(xù)釋放的PH、鹽濃度、溶劑、穩(wěn)定劑以及釋放 改性劑。
[0032] 本文所披露的實(shí)施例可包括：（i)包括治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)部水相，治療性蛋白質(zhì)以 儲(chǔ)槽式調(diào)配物的重量計(jì)0.025重量％到5重量％存在；（ii )基于聚合物的油/固相；以及 (i i i)包括以?xún)?chǔ)槽式調(diào)配物的重量計(jì)0.01重量％到1重量％存在的表面活性劑的外部水相， 其中儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。
[0033] 在各種實(shí)施例中，儲(chǔ)槽式調(diào)配物包括由內(nèi)部水相和聚合物相制成的粒子。在多個(gè) 實(shí)施例中，儲(chǔ)槽式調(diào)配物包括由內(nèi)部水相和水相包圍的聚合物相制成的粒子。
[0034] 聚合物.本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物中所用的具體聚合物組合物和制劑提供在生 理?xiàng)l件下形成允許從所述結(jié)構(gòu)持續(xù)釋放治療性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的化學(xué)微環(huán)境。在具體實(shí)施例 中，通過(guò)例如經(jīng)水合聚合物基質(zhì)擴(kuò)散的過(guò)程產(chǎn)生持續(xù)釋放。
[0035] 聚合物通常可以是僅微溶或不溶于水；以及在向受試者投予之后生物相容和可生 物降解。"微溶"意思是聚合物在水中溶解不超過(guò)3重量％。本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物中所 用的聚合物的平均分子量一般在3，000道爾頓(Da)到100，000Da范圍內(nèi)，并且在具體實(shí)施例 中，約3，000到20，000Da范圍內(nèi)。這些聚合物的多分散性通常在1.1到4.0范圍內(nèi)。具體儲(chǔ)槽 式調(diào)配物中所用的生物相容性聚合物的量取決于治療性蛋白質(zhì)的藥理學(xué)活性強(qiáng)度和其所 要釋放速率。
[0036] 聚合物的化學(xué)性質(zhì)可包括酸，脂肪族聚酯（均聚物，例如聚（乳酸）），共聚物，例如 聚(丙交酯-共_乙交酯）、羥基羧酸、羥基酸、聚(氨基酸)和/或聚(氰基丙烯酸)酯。最優(yōu)選 為乳酸和/或乙醇酸的酯，即聚（丙交酯）、聚（乙交酯）和/或PLG。本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配 物還可包括這些聚合物的聚乙二醇化、乙氧基化和其它衍生型式，包括親水性（羧基封端 的)和更疏水性(酯封端的)封端結(jié)構(gòu)。
[0037] 在具體實(shí)施例中，示范性聚合物包括可生物降解聚合物，包括具有所要丙交酯：乙 交酯比率、平均分子量、多分散性和末端基團(tuán)化學(xué)性質(zhì)的聚(丙交酯）、聚（乙交酯）、聚（己內(nèi) 酯)和聚(丙交酯)_共（乙交酯）（PLG)。
[0038] 在各種實(shí)施例中，所用聚合物可以是羧基封端的中等分子量PLG。"低分子量"指的 是聚合物的分子量為l，〇〇〇Da到10,000Da。"中等分子量"指的是分子量為10,000Da到25， OOODa的聚合物。"高分子量"指的是分子量大于25,000Da的聚合物。
[0039] 在具體實(shí)施例中，所用聚合物可以是 分子量為5.9kDa的羧基封端的PLG聚合物。PLG2A是分子量為13.6kDa的羧基封端的PLG聚合 物。PLG3A是分子量為32kDa的羧基封端的PLG聚合物。PLG5E是分子量為75kDa的酯化PLG聚 合物。PLG7E是分子量為68kDa的酯化PLG聚合物。使用多種等級(jí)以不同比率摻合不同聚合物 類(lèi)型可導(dǎo)致從貢獻(xiàn)聚合物中的每一者借用的特征。因此，還可以使用摻合物和共聚物。摻合 物包括不同聚合物的混合物。共聚物包括由至少兩種不同構(gòu)成單體制成的那些。
[0040]溶劑和賦形劑.通過(guò)水解聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯）的酯鍵形成的強(qiáng)酸性微環(huán)境 提供可能不利影響治療性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性的苛刻環(huán)境。為了克服這些挑戰(zhàn)，本文所披露的 儲(chǔ)槽式調(diào)配物的內(nèi)部水相可以通過(guò)緩沖液和鹽溶液控制pH。內(nèi)部水相可以通過(guò)組合pH緩沖 劑物質(zhì)和賦形劑來(lái)穩(wěn)定，賦形劑包括乙酸、碳酸、磷酸，以及鹽，例如磷酸氫鈉，鹽酸、氫氧化 鈉、精氨酸和賴(lài)氨酸。在具體實(shí)施例中，使用具有140mM氯化鈉鹽的磷酸鹽緩沖水溶液。在具 體實(shí)施例中，這些緩沖系統(tǒng)設(shè)計(jì)成保持儲(chǔ)槽式調(diào)配物的內(nèi)部水相的pH高于6。
[0041 ] 在具體實(shí)施例中，內(nèi)部水相的pH為6.0、7.0、7.4或8.0(磷酸鹽緩沖液）；5.0或6.0 (組氨酸）；4.5、5.0或6.0(檸檬酸鹽）；4.5、5.0或5.5(乙酸鹽）、Mg(0H)2。使用NaCl、KCl 和/ 或CaCl2可以使內(nèi)部水相的離子強(qiáng)度是0-200mM。
[0042]內(nèi)部水相還可包括蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，例如白蛋白、明膠、檸檬酸、乙二胺鈉乙酸四銨、 糊精、硫酸氫鈉、多元醇，例如聚（乙二醇），和/或防腐劑，例如對(duì)羥基甲苯、對(duì)羥基苯甲酸酯 (對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯）、苯甲醇、氯丁醇和硫柳汞。
[0043]使用不同溶劑（例如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、三醋精、N-甲基吡咯烷酮、四氫呋 喃、酚類(lèi)或其組合)可改變粒徑和結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)釋放特征。其它適用溶劑包括水、乙醇、二甲亞 砜(DMS0)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、丙酮、甲醇、異丙醇（IPA)、苯甲酸乙酯和苯甲酸苯甲 酯。
[0044]例如表面活性劑、清潔劑、內(nèi)相粘度強(qiáng)化劑、復(fù)合劑、表面活性分子、共溶劑、螯合 劑、穩(wěn)定劑、纖維素衍生物、（羥丙基）甲基纖維素(HPMC)、乙酸HPMC、乙酸纖維素、普朗尼克 (pluronics)(例如F68/F127)、聚山梨醇酯、.Span? (特拉華州威明頓的美國(guó)禾大（Croda Americas，Wilmington，Delaware))、聚（乙稀醇）（PVA)、BrijK (特拉華州威明頓的美國(guó)禾 大）、乙酸異丁酸蔗糖(SAIB)、鹽和緩沖劑的釋放改性劑也可以改變儲(chǔ)槽式調(diào)配物的治療性 蛋白質(zhì)釋放的特性。
[0045]分配到儲(chǔ)槽式調(diào)配物的內(nèi)粒子的外相邊界的賦形劑，例如表面活性劑，包括聚山 梨醇酯、二辛基磺基丁二酸酯、泊洛沙姆和PVA，也可以用有利方式改變包括粒子穩(wěn)定性和 侵蝕速率、水合作用和通道結(jié)構(gòu)、界面?zhèn)鬏敽蛣?dòng)力學(xué)的特性。粒子的外相邊界(可以通過(guò)例 如內(nèi)部水相周?chē)木酆衔锕腆w/油相形成)為包圍粒子的外部水相附近的粒子部分。
[0046] 在具體實(shí)施例中，外部水相的pH可以在5.5-8.5范圍內(nèi)并且可包括0-200mM范圍中 的磷酸鹽、檸檬酸鹽，以及包括NaCl、KCl和/或CaCl2的鹽。
[0047]不同表面活性劑物質(zhì)還可以用于穩(wěn)定本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物以及所述的乳 液。示范性表面活性劑包括環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷摻合物(PE0-PP0)二嵌段和三嵌段共聚物， 脫水山梨糖醇酯，例如Tween? (特拉華州威明頓的美國(guó)禾大）、Span?、p VA、Brij 3?、 Eudragit? (德國(guó)達(dá)姆施塔特的贏倉(cāng)ij羅姆有限公司（Evonik R.Shm.GmbH,Darmstadt， Germany ))、泊洛沙姆、多庫(kù)酯鈉以及SDDS。
[0048]所披露儲(chǔ)槽式調(diào)配物的額外處理可利用穩(wěn)定賦形劑，包括甘露糖醇、蔗糖、海藻糖 以及甘氨酸，在例如Tris、檸檬酸鹽或組氨酸的緩沖劑中，與例如聚山梨醇酯、PVA和二辛基 磺基丁二酸酯的其它組分一起進(jìn)行。也可以使用產(chǎn)生復(fù)原成初始懸浮液的類(lèi)似尺寸和效能 特征的極低水分粉末的冷凍-干燥循環(huán)。
[0049] 治療性蛋白質(zhì).作為本文所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的部分提供的治療性蛋白質(zhì)可包括 與前述控制釋放組合物中所發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)相比長(zhǎng)度較長(zhǎng)和/或結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的蛋白質(zhì)。
[0050] 示范性治療性蛋白質(zhì)為基于毒素的治療性蛋白質(zhì)。用于本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配 物的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的具體實(shí)例結(jié)合電壓門(mén)控性通道。示范性電壓門(mén)控性通道包 括Kvl.l、Kvl.2、Kvl.3、Kvl.4、Kvl.5、Kvl.6、Kvl.7、Kv2.1、Kv3.1、Kv3.2、Kvll.l、Kcl.l、 Kc2 ? 1、Kc3 ? 1、Navl ? 2、Navl ? 4以及Cavl ? 2通道。
[0051]毒素蛋白質(zhì)由多種生物體產(chǎn)生并且已演化成結(jié)合到離子通道和受體。來(lái)自蛇、蝎、 蜘蛛、蜜蜂、蝸牛和?？脑舅氐鞍踪|(zhì)的長(zhǎng)度通常為10-80個(gè)氨基酸并且包括2到5個(gè)形 成致密分子結(jié)構(gòu)的二硫橋鍵。這些蛋白質(zhì)看起來(lái)已從少數(shù)結(jié)構(gòu)構(gòu)架演化。蛋白質(zhì)叢集成折 疊圖案家族，其通過(guò)半胱氨酸/二硫化物環(huán)結(jié)構(gòu)保守以維持有助于效能、穩(wěn)定性和選擇性的 三維結(jié)構(gòu)，其全部為形成本發(fā)明的儲(chǔ)槽式調(diào)配物時(shí)至關(guān)重要的要素。（彭寧頓(Pennington) 等人，生物化學(xué)(Biochemistry) ,38,14549-14558(1999);脫特(Tudor)等人，歐洲生物化學(xué) 雜志（Eur.J.Biochem. )，251,133-141(1998);以及賈維（Jaravine)等人，生物化學(xué) (Biochemistry),36,1223-1232,(1997))〇
[0052] "基于毒素的治療性蛋白質(zhì)"包括表1的基于毒素的蛋白質(zhì)(或其變異體、D-取代的 類(lèi)似物、羧基末端酰胺、改性、衍生物或藥學(xué)上可接受的鹽），和表2的基于ShK的蛋白質(zhì)(或 其變異體、D-取代的類(lèi)似物、羧基末端酰胺、修飾物、衍生物或藥學(xué)上可接受的鹽）?；诙?素的治療性蛋白質(zhì)可以是合成或天然存在的。
[0053] "基于毒素的蛋白質(zhì)"包括任何合成或天然已知毒素蛋白質(zhì)和表1中披露的那些蛋 白質(zhì)，以及其變異體、D-取代的類(lèi)似物、羧基末端酰胺、修飾物、衍生物或藥學(xué)上可接受的 鹽。用于儲(chǔ)槽式調(diào)配物和用于本文所披露的方法中的具體示范性基于毒素的治療性蛋白質(zhì) 包括表1中所列的基于毒素的蛋白質(zhì)，并且如序列表中作為SEQ ID N0:225-256所列出。
[0055] ShK為通過(guò)三個(gè)二硫橋鍵交聯(lián)的高度結(jié)構(gòu)化35殘基蛋白質(zhì)，其活性關(guān)鍵取決于其 三維結(jié)構(gòu)。保持這一治療性蛋白質(zhì)的效能的儲(chǔ)槽式調(diào)配物需要穩(wěn)定和保留前述調(diào)配嘗試中 并非必需或解決的高級(jí)結(jié)構(gòu)要素并且因此提供治療性治療的改良。
[0056] ShK蛋白質(zhì)為可用于本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物和方法的毒素蛋白質(zhì)亞型。ShK蛋 白質(zhì)最初從加勒比海葵地毯?？?Stichodactyla helianthus)分離。ShK蛋白質(zhì)用作Kvl .3 通道的抑制劑。通過(guò)抑制Kv 1.3通道，在某些實(shí)施例中，ShK蛋白質(zhì)可抑制皮摩爾濃度的效應(yīng) 記憶細(xì)胞(Tem)的活化、增殖和/或細(xì)胞激素產(chǎn)生或通過(guò)皮摩爾濃度的效應(yīng)記憶細(xì)胞(Tem)抑 制活化、增殖和/或細(xì)胞激素產(chǎn)生。
[0057] "抑制劑"為降低或消除生物活性的任何基于毒素的治療性蛋白質(zhì)，所述生物活性 通常是基于化合物與受體的相互作用的結(jié)果，包括生物合成和/或催化活性、受體、或信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑活性、基因轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)譯、細(xì)胞蛋白傳輸?shù)取?br>[0058] 原生S h K蛋白質(zhì)描述于例如彭寧頓等人，國(guó)際肽和蛋白質(zhì)研究雜志 (Int. J.Pept .Protein Res.) ,46,354-358(1995)中。在本發(fā)明范圍內(nèi)的示范性ShK結(jié)構(gòu)還 公開(kāi)于Beeton等人，分子藥理學(xué)(Mol .Pharmacol.) ,67，1369-1381 (2005);美國(guó)公開(kāi)案第 2008/0221024號(hào)；？(：1'公開(kāi)案第10/2012/170392號(hào)；以及美國(guó)專(zhuān)利第8,080,523號(hào)和第8， 440,621 號(hào)中。
[0059] "基于ShK的蛋白質(zhì)"包括任何合成或天然已知ShK蛋白質(zhì)以及其變異體、D-取代類(lèi) 似物、羧基末端酰胺、修飾物、衍生物和藥學(xué)上可接受的鹽。
[0060]用于本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物中的具體示范性基于ShK的蛋白質(zhì)包括表2中列 出的那些，并且在序列表中作為3￡〇10^):1-224和3￡〇10^):257-260顯示。用于本文所 披露的具體實(shí)施例中的基于ShK的蛋白質(zhì)包括SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0: 208、SEQ ID N0:257、SEQ ID N0:223、SEQ ID N0:210、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:218以及 SEQ ID NO:221 的那些。





[0067]
[0068] 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員了解設(shè)計(jì)具有增強(qiáng)特性的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的技術(shù)， 例如丙氨酸掃描、使用已知序列的基于比對(duì)介導(dǎo)的突變誘發(fā)的合理設(shè)計(jì)和/或分子建模。舉 例來(lái)說(shuō)，基于毒素的治療性蛋白質(zhì)可以設(shè)計(jì)成去除蛋白酶裂解位點(diǎn)（例如K或R殘基處的胰 蛋白酶裂解位點(diǎn)和/或F、Y或W殘基處的胰凝乳蛋白酶裂解位點(diǎn)）。非水解磷酸酯取代也對(duì)磷 酸酯基賦予穩(wěn)定作用以及針對(duì)磷酸酶的穩(wěn)定性。非水解磷酸酯基包括磷酸酪氨酸的膦酸酯 類(lèi)似物，例如4-膦?；谆奖彼?Pmp)、4-膦?；谆奖彼?F2Pmp)、對(duì)膦酰基 苯丙氨酸、單氟膦?；谆奖彼?、磺酰基(二氟甲基)苯丙氨酸(F2Smp)和羥基膦?；?基苯丙氨酸。在其它實(shí)施例中，可使用磷酸酪氨酸模擬物，例如〇MT、FOMT和利用羧酸基復(fù)制 磷酸酯基官能度的其它類(lèi)似物，如布爾克(131^1^)和李，化學(xué)研究評(píng)述(4(^.〇16111.1^8.)， 36,426-433(2003)中所述。在另一實(shí)施例中，非水解類(lèi)似物包括甲基-、芳氧基-和硫基-乙 基磷酸。在另一實(shí)施例中，非水解磷酸酯衍生物包括二氟亞甲基膦酸和二氟亞甲基磺酸。
[0069] 為了提高基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)(PK/PD)特性， 可取代、置換或改性對(duì)降解特性敏感的殘基。用酰胺改性C端酸官能也可以賦予穩(wěn)定性。基 于毒素的治療性蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)的這些改變可以與N端的陰離子部分組合產(chǎn)生穩(wěn)定和選 擇性Kvl.3阻斷劑。為了制造具有較高體內(nèi)半衰期的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)，可以制備蛋 白質(zhì)的變異體或修飾物，其中關(guān)鍵蛋白水解消化位點(diǎn)可以經(jīng)取代以降低蛋白酶敏感性。這 可以包括用保守電子等排置換(例如Lys置換成Lys(乙?；?或Gin)和或中性置換(Ala)取 代非必需殘基。
[0070] 本文所披露的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的"變異體"包括相較于本文所披露的基 于毒素或基于ShK的蛋白質(zhì)具有一或多個(gè)氨基酸添加、缺失、停止位置或取代的蛋白質(zhì)。
[0071] 氨基酸取代可以是保守或非保守取代。本文所披露的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的 變異體可包括具有一或多個(gè)保守氨基酸取代的那些。"保守取代"涉及以下保守取代基中的 一者中存在的取代:第1組:丙氨酸(Ala;A)、甘氨酸(Gly;G)、絲氨酸(Ser;S)、蘇氨酸(Thr; T);第2組:天冬氨酸(Asp;D)、谷氨酸(Glu;E);第3組:天冬酰胺(Asn;N)、谷酰胺(Gln;Q);第 4組:精氨酸(Arg; R)、賴(lài)氨酸（Lys ;K)、組氨酸(His ; H);第5組：異亮氨酸（I le ; I)、亮氨酸 (Leu;L)、甲硫氨酸(Met ;M)、結(jié)|氨酸(Val ;V);以及第6組:苯丙氨酸(Phe ;F)、酪氨酸(Tyr; Y)、色氨酸(Trp;W)。
[0072] 另外，氨基酸可以根據(jù)類(lèi)似功能、化學(xué)結(jié)構(gòu)或組成(例如酸性、堿性、脂肪族、芳香 族或含硫)分組成保守取代基。舉例來(lái)說(shuō)，為了取代，脂肪族分組可包括Gly、Ala、Val、Lei^P lie。包括彼此視為保守取代的氨基酸的其它組包括:含硫:Met和Cys;酸性:Asp、Glu、Asn和 61]1 ;小脂肪族非極性或微極性殘基:413、361'、1'111'、？1'〇和617;極性帶負(fù)電殘基和其酰胺 ： Asp、Asn、Glu和Gin;極性帶正電殘基:His、Arg和Lys;大脂肪族非極性殘基:Met、Leu、lie、 Val和Cys;以及大芳香族殘基:Phe、Tyr和Trp。額外信息見(jiàn)于克賴(lài)頓(Creighton) (1984)蛋 白質(zhì)（Proteins)，W.H.弗里曼和公司（W.H.Freeman and Company)。
[0073] 本文所披露的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的變異體還包括與本文所披露的蛋白質(zhì) 序列具有至少70 %序列一致性、至少80 %序列一致性、至少85 %序列一致性、至少90 %序列 一致性、至少95 %序列一致性、至少96 %序列一致性、至少97 %序列一致性、至少98 %序列 一致性或至少99%序列一致性的蛋白質(zhì)。
[0074] 用于本文所披露的以基于毒素的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的基于毒素的治 療性蛋白質(zhì)的變異體包括以下蛋白質(zhì)，其與SEQ ID N0:225-256中任一者共享70%序列一 致性；與SEQ ID N0:225-256中任一者共享75%序列一致性；與SEQ ID N0:225-256中任一 者共享80%序列一致性；與SEQ ID NO: 225-256中任一者共享81 %序列一致性；與SEQ ID NO: 225-256中任一者共享82%序列一致性；與SEQ ID NO: 225-256中任一者共享83%序列 一致性；與SEQ ID N0:225-256中任一者共享84%序列一致性；與SEQ ID N0:225-256中任 一者共享85%序列一致性;與SEQ ID N0:225-256中任一者共享86%序列一致性;與SEQ ID NO: 225-256中任一者共享87%序列一致性；與SEQ ID NO: 225-256中任一者共享88%序列 一致性；與SEQ ID N0:225-256中任一者共享89%序列一致性；與SEQ ID N0:225-256中任 一者共享90%序列一致性;與SEQ ID N0:225-256中任一者共享91%序列一致性;與SEQ ID NO: 225-256中任一者共享92%序列一致性；與SEQ ID NO: 225-256中任一者共享93%序列 一致性；與SEQ ID N0:225-256中任一者共享94%序列一致性；與SEQ ID N0:225-256中任 一者共享95%序列一致性;與SEQ ID N0:225-256中任一者共享96%序列一致性;與SEQ ID NO: 225-256中任一者共享97%序列一致性；與SEQ ID NO: 225-256中任一者共享98%序列 一致性;或與SEQ ID N0:225-256中任一者共享99%序列一致性。
[0075] 用于本文所披露的以基于ShK的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的基于毒素的治療 性蛋白質(zhì)的變異體包括以下蛋白質(zhì)，其與3￡〇10勵(lì)：1-224和/或3￡〇10^) :257-260中任 一者共享80%序列一致性；與3￡〇10^):1-224和/或3￡〇10^) :257-260中任一者共享 81%序列一致性；與3￡〇10勵(lì)：1-224和/或3￡〇10勵(lì)：257-260中任一者共享82%序列一 致性；與SEQ ID N0:l-224和/或SEQ ID N0:257-260中任一者共享83%序列一致性；與SEQ 10勵(lì)：1-224和/或5￡〇10勵(lì)：257-260中任一者共享84%序列一致性；與5￡〇10勵(lì)：1-224 和/或SEQ ID N0:257-260中任一者共享85%序列一致性；與SEQ ID N0:1-224和/或SEQ ID NO: 257-260中任一者共享86%序列一致性；與SEQ ID NO: 1-224和/或SEQ ID NO: 257-260 中任一者共享87%序列一致性；與3￡〇10^):1-224和/或3￡〇10^) :257-260中任一者共 享88%序列一致性；與3￡〇10勵(lì)：1-224和/或3￡〇10^):257-260中任一者共享89%序列 一致性；與SEQ ID N0:l-224和/或SEQ ID N0:257-260中任一者共享90%序列一致性；與 5￡〇10勵(lì)：1-224和/或5￡〇10腸：257-260中任一者共享91%序列一致性；與5￡〇10如： 1-224和/或SEQ ID N0:257-260中任一者共享92%序列一致性；與SEQ ID如：1-224和/或 5￡〇10勵(lì)：257-260中任一者共享93%序列一致性；與5￡〇10腸：1-224和/或5￡〇10如： 257-260中任一者共享94%序列一致性；與SEQ ID N0:1-224和/或SEQ ID N0:257-260中任 一者共享95%序列一致性；與3￡〇10^):1-224和/或3￡〇10^) :257-260中任一者共享 96%序列一致性；與5￡〇10勵(lì)：1-224和/或5￡〇10勵(lì)：257-260中任一者共享97%序列一 致性 ；與3￡〇10^):1-224和/或3￡〇10^):257-260中任一者共享98%序列一致性 ；或與 SEQ ID NO: 1-224和/或SEQ ID NO:257-260中任一者共享99%序列一致性。
[0076]具體示范性實(shí)施例包括基于毒素的治療性蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)與SEQ ID NO: 208共用80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序列一 致性、89 %序列一致性、90 %序列一致性、91 %序列一致性、92 %序列一致性、93 %序列一致 性、94 %序列一致性、95 %序列一致性、96 %序列一致性、97 %序列一致性、98 %序列一致性 或99%序列一致性。在另一實(shí)施例中，變異體包括的蛋白質(zhì)與SEQ ID N0:209共用80%序列 一致性、85 %序列一致性、86 %序列一致性、87 %序列一致性、88 %序列一致性、89 %序列一 致性、90 %序列一致性、91 %序列一致性、92 %序列一致性、93 %序列一致性、94 %序列一致 性、95 %序列一致性、96 %序列一致性、97 %序列一致性、98 %序列一致性或99 %序列一致 性。在另一實(shí)施例中，變異體包括的蛋白質(zhì)與SEQ ID N0:217共用80%序列一致性、85%序 列一致性、86 %序列一致性、87 %序列一致性、88 %序列一致性、89 %序列一致性、90 %序列 一致性、91 %序列一致性、92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一 致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一致性或99%序列一致性。在另一實(shí)施 例中，變異體包括的蛋白質(zhì)與SEQ ID N0:210共用80%序列一致性、85%序列一致性、86% 序列一致性、87 %序列一致性、88 %序列一致性、89 %序列一致性、90 %序列一致性、91 %序 列一致性、92 %序列一致性、93 %序列一致性、94 %序列一致性、95 %序列一致性、96 %序列 一致性、97%序列一致性、98%序列一致性或99%序列一致性。在另一實(shí)施例中，變異體包 括的蛋白質(zhì)與SEQ ID N0:218共用80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、 87 %序列一致性、88 %序列一致性、89 %序列一致性、90 %序列一致性、91 %序列一致性、 92%序列一致性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、 97 %序列一致性、98%序列一致性或99 %序列一致性。在另一實(shí)施例中，變異體包括的蛋白 質(zhì)與SEQ ID N0: 208共用80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一 致性、88 %序列一致性、89 %序列一致性、90 %序列一致性、91 %序列一致性、92 %序列一致 性、93%序列一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致 性、98%序列一致性或99%序列一致性。在另一實(shí)施例中，變異體包括的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO: 257共用80%序列一致性、85%序列一致性、86%序列一致性、87%序列一致性、88%序 列一致性、89%序列一致性、90%序列一致性、91 %序列一致性、92%序列一致性、93%序列 一致性、94%序列一致性、95%序列一致性、96%序列一致性、97%序列一致性、98%序列一 致性或99 %序列一致性。
[0077] "序列一致性％ "指的是如通過(guò)比較序列所測(cè)定的兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的關(guān)系。 所屬領(lǐng)域中，"一致性"還意味著如通過(guò)此類(lèi)序列串之間的匹配測(cè)定的蛋白質(zhì)序列之間的序 列親緣關(guān)系程度。"一致性"（通常稱(chēng)為"相似性"）容易通過(guò)已知方法計(jì)算:包括以下中所述 的那些:計(jì)算分子生物學(xué)(Computational Molecular Biology)(萊斯克A.M. (Lesk，A.M.) 編.）牛津大學(xué)出版社（Oxford University Press)，紐約（NY)(1988);生物計(jì)算：信息學(xué)和 基因組計(jì)劃（Biocomputing: Informatics and Genome Projects)(史密斯D.W(Smith， D .W.)編）學(xué)術(shù)出版社（Academic Press)，紐約（NY) (1994);序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析 (Computer Analysis of Sequence Data),第I 部（格里芬 A.M. (Griffin, A.M.)和格里芬 H. G.編）胡馬納出版社(Humana Press)，新澤西州(NJ) (1994);分子生物學(xué)中的序列分析 (Sequence Analysis in Molecular Biology)(范海捏G. (Von Heijne，G.)編）學(xué)術(shù)出版社 (1987);以及序列分析引物（Sequence Analysis Primer)(格里布科夫M. (Gribskov，M.)和 德弗羅J.(DeVereUX，J.)編）牛津大學(xué)出版社，紐約（1992)。測(cè)定序列一致性的優(yōu)選方法設(shè) 計(jì)成獲得所測(cè)試序列之間的最佳匹配。在公開(kāi)可用的計(jì)算機(jī)程序中編碼用于測(cè)定序列一致 性和相似性的方法。序列比對(duì)和一致性百分比計(jì)算可以使用LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算程 序組（威斯康星麥迪遜的 DNASTAR公司（DNASTAR，Inc ?，Madison，Wisconsin))的Megalign程 序進(jìn)行。也可以使用Clustal比對(duì)法(希金斯和夏普CABIOS(Higgins and Sharp CABIOS), 5,151-153(1989)用默認(rèn)參數(shù)(空位罰分= 10,空位長(zhǎng)度罰分=10)進(jìn)行序列的多序列比對(duì)。 相關(guān)程序還包括GCG編程程序組(威斯康星套裝9.0版(Wisconsin Package Version 9.0)， 遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(GCG),麥迪遜(Madison),威斯康星(Wisconsin) );BLASTP、BLASTN、BLASTX (阿爾丘爾(Altschul)等人，分子生物學(xué)雜志（J.Mol.Biol.)215 :403-410(1990);DNASTAR (威斯康星麥迪遜的DNASTAR公司）；以及并入史密斯-沃特曼算法（Smith-Waterman algorithm)的FASTA程序（皮爾遜（Pearson)，計(jì)算機(jī)方法基因組研究（Comput .Methods Genome Res ?)，[國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議(Proc ? Int ? Symp ?) ] (1994)，會(huì)議日期 1992，111-20 ?編輯:舒 豪伊（Suhai)，桑德?tīng)枺⊿andor) ?出版商：普雷納姆(Plenum)，紐約（New York)，紐約(N.Y.) 州。在本發(fā)明的情境內(nèi)，應(yīng)理解如果使用序列分析軟件進(jìn)行分析，那么分析結(jié)果是基于所提 及程序的"默認(rèn)值"。"默認(rèn)值"意味著軟件最初初始化時(shí)初始加載的值或參數(shù)的任何組。
[0078] "D-取代的類(lèi)似物"包括本文所披露的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)，其一或多個(gè)L-氨 基酸經(jīng)D-氨基酸取代。D-氨基酸可以是與蛋白質(zhì)序列中存在的氨基酸相同的氨基酸類(lèi)型或 可以是不同氨基酸。因此，D-類(lèi)似物也是變異體。
[0079] "修飾"包括本文所披露的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)，其中一或多個(gè)氨基酸已置換 成非氨基酸組分，或其中氨基酸已結(jié)合到官能團(tuán)或官能團(tuán)已另外與氨基酸或蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)。 經(jīng)修飾的氨基酸可以是例如糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法呢基化氨基酸、乙酰化氨 基酸、生物素化氨基酸、結(jié)合到脂質(zhì)部分的氨基酸、結(jié)合到人類(lèi)血清白蛋白的氨基酸或結(jié)合 到有機(jī)衍生劑的氨基酸。經(jīng)修飾氨基酸的存在可以有利于例如(a)提高蛋白質(zhì)血清半衰期 和/或功能性體內(nèi)半衰期，（b)降低蛋白質(zhì)抗原性，（c)提高蛋白質(zhì)儲(chǔ)存穩(wěn)定性，（d)提高蛋白 質(zhì)溶解度，（e)延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間和/或⑴提高生物可用性，例如增加曲線下面積(AUCsc)。氨基 酸可以例如在重組制造期間共轉(zhuǎn)譯或轉(zhuǎn)移后修飾(例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)期間在N-X-S/T基元處N-連接的糖基化)或通過(guò)合成方式修飾。經(jīng)修飾氨基酸可以在序列內(nèi)或在序列末 端。修飾可包括如本文其它地方所述的衍生物。
[0080] C端可以是基于毒素的治療性蛋白質(zhì)中每一種的羧酸基或酰胺基，優(yōu)選羧酸基。本 發(fā)明還涉及通過(guò)以下進(jìn)一步修飾的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)：（i)對(duì)C端添加，例如17^碘_ Tyr、熒光標(biāo)簽，或（ii)對(duì)N端添加，例如Tyr、碘-Tyr、焦谷氨酸酯基或熒光標(biāo)簽。
[0081] 另外，可向C端和/或N端添加熟練技術(shù)人員已知提高穩(wěn)定性的殘基或殘基群組。另 外，可向C端和/或N端添加熟練技術(shù)人員已知提高口服可用性的殘基或殘基群組。
[0082]在具體實(shí)施例中，C端為酸（例如C00H)或酰胺(例如C0NH2)。"酰胺"指的是在具體 實(shí)施例中連接到蛋白質(zhì)的C端的NH2。在多個(gè)實(shí)施例中，酸的C端羥基(0H)經(jīng)酰胺取代。此類(lèi) 取代在本文使用術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)"酰胺"命名或命名為C端氨基酸-NH 2，如在"-Cys-NH2"中。
[0083]已研究多種治療性蛋白質(zhì)的安全性、效能和特異性，并且將蛋白質(zhì)連接到具有陰 離子型電荷的有機(jī)或無(wú)機(jī)化學(xué)實(shí)體已顯示改良醫(yī)藥組合物的適用性。連接位點(diǎn)可以是N端， 但修飾不限于這一位點(diǎn)處的連接。
[0084]適當(dāng)化學(xué)實(shí)體的實(shí)例包括L-Pmp(0H2) ;D-Pmp(0H2) ;D-Pmp(0HEt) ;Pmp(Et2) ;D-Pmp (￡七2)汰-17〇1^174?03112)(對(duì)-磷酸基-酪氨酸）汰-?116(口-順 2);1-?116(口-〇)21〇;1-天冬氨 酸;D-天冬氨酸;L-谷氨酸；以及D-谷氨酸。所用縮寫(xiě)如下定義:Pmp(對(duì)-膦酰基甲基-苯丙氨 酸）；和Ppa(對(duì)-磷脂酰-苯丙氨酸hPmP和Ppa的替代包括Pfp(對(duì)-膦?；?二氟-甲基)_苯丙 氨酸)和Pkp (對(duì)-膦酰基-甲基酮基-苯丙氨酸）。
[0085]示范性化學(xué)實(shí)體可以通過(guò)以下方式連接:連接基團(tuán)，例如氨基乙氧基乙氧基-乙酸 連接基團(tuán)（在本文中稱(chēng)為AEEAc)或通過(guò)任何其它適合方式?；瘜W(xué)實(shí)體/連接基團(tuán)組合的實(shí)例 包括AEEAc-L-Pmp(0H 2) ;AEEAc-D-Pmp(0H2) ;AEEAc-D-Pmp(OHEt) ;AEEAc-L-Pmp(Et2); AEEAc-D-Pmp(Et2) ；AEEAc-L-Tyr；AEEAc-L-Tyr(P〇3H2) ；AEEAc-L-Phe(p-NH2) ；AEEAc-L-Phe (p-C〇2H); AEEAc-L-天冬氛酸;AEEAc-D-天冬氛酸;AEEAc-L-谷氛酸；以及AEEAc-D-谷氛酸。 在化學(xué)實(shí)體中，一般來(lái)說(shuō)，如果氨基酸殘基具有手性中心，那么可使用氨基酸殘基的D和/或 L對(duì)映異構(gòu)體。
[0086]本文所披露的全部基于毒素的治療性蛋白質(zhì)可以通過(guò)AEEAc的N-端連接和/或C端 處的酰胺連接(例如3111(-186(5￡〇10勵(lì):217)和5111(-192(5￡〇10勵(lì):218))修飾。當(dāng)在形成 過(guò)程中用于描述連接基團(tuán)時(shí)，AEEAc可互換地指氨基乙氧基乙氧基乙酸和Fmoc-氨基乙氧基 乙氧基乙酸。當(dāng)用于指最終狀態(tài)的特異性蛋白質(zhì)中的連接基團(tuán)時(shí)，術(shù)語(yǔ)指的是氨基乙氧基 乙氧基乙酸。
[0087]本文所披露的全部基于毒素的治療性蛋白質(zhì)可以通過(guò)添加以下來(lái)修飾:聚乙二醇 (PEG)、人類(lèi)血清白蛋白、抗體、脂肪酸、包括Fab和Fc區(qū)的抗體片段、羥乙基淀粉、聚葡萄糖、 低聚糖、聚唾液酸、玻尿酸、糊精、聚(2-乙基2-噁唑酮）、聚谷氨酸(PGA)、N_(2-羥丙基）甲基 丙烯酰胺共聚物(HPMA)、包括以下的氨基酸的非結(jié)構(gòu)化親水性序列：具體來(lái)說(shuō)氨基酸Ala、 Glu、Gly、Ser和Thr，以及如以下中所述的許多其它連接基團(tuán)和添加:施密特S.R. (Schmidt, S.R.)(編），革巴向生物藥品的融合蛋白：應(yīng)用和攻毒（Fusion Protein Targeting for Biopharmaceuticals: Applications and Challenges),約翰?威利父子出版公司（John Wiley and Sons):新澤西州霍博肯(Hoboken New Jersey),2013166基團(tuán)可以使用以下連 接到賴(lài)氨酸的e氨基：（a)PEG丁二酰亞胺基碳酸酯，（b)PEG苯并三唑碳酸酯，（c)PEG二氯三 嗪，（d)PEG三氟乙磺酸酯，（e)PEG對(duì)-硝基苯基碳酸酯，（f)PEG三氯苯基碳酸酯，（g)PEG羰基 咪唑，和(h)PEG 丁二酰亞胺基丁二酸酯。PEG基團(tuán)可以通過(guò)可降解連接基團(tuán)（包括氨基甲酸 苯甲酯的對(duì)或鄰二硫化物)連接到半胱氨酸。定點(diǎn)引入PEG可以通過(guò)用PEG-醛還原性烷基化 或通過(guò)在氰基硼氫化鈉存在下a-氨基的甘油醛改性來(lái)實(shí)現(xiàn)。PEG化化學(xué)性質(zhì)已在許多公開(kāi) 案中加以描述，包括羅伯特(Robert)等人，先進(jìn)藥物傳遞評(píng)論(Advanced Drug Delivery Reviews) ,54,459-476(2002)。低聚糖可以是N-連接或0-連接的。通過(guò)連接到Xxx為除脯氨 酸以外的任何氨基酸的Asn-Xxx-Ser/Thr共同序列來(lái)制造細(xì)胞株，從而添加N-連接低聚糖 (包括聚唾液酸）。〇_連接的低聚糖連接到Ser或Thr。
[0088]具體實(shí)施例包括基于毒素的治療性蛋白質(zhì)SEQ ID NO: 1-260,其通過(guò)AEEAc連接有 具有陰離子型電荷的有機(jī)或無(wú)機(jī)化學(xué)實(shí)體。
[0089]基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的另一實(shí)例為ShK-186的基于ShK的D0TA結(jié)合物（稱(chēng)為 3證-221)。"0(^"指的是1，4,7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4,7，10-四乙酸，其可以經(jīng)氨基己酸 連接到本文所披露的治療性蛋白質(zhì)的N端。DOTA結(jié)合提供針對(duì)螯合金屬原子(例如銦或釓） 的位點(diǎn)?？梢越Y(jié)合到本文所披露的治療性蛋白質(zhì)的其它分子包括二亞乙基三胺五乙酸 (DTPA)、次氮基三乙酸（NTA)、乙二胺四乙酸（EDTA)、亞胺二乙酸（IDA)、乙二醇四乙酸 (￡6丁4)、1，2-雙(〇-氨基苯氧基）乙烷，，^』'-四乙酸(84?了4)、1，4,7-三氮雜環(huán)壬烷，， N'，N〃-三乙酸(N0TA)和相關(guān)分子。
[0090] 本發(fā)明進(jìn)一步針對(duì)所披露基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的衍生物。"衍生物"包括具有 非周期排列的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)，其中環(huán)排列保留原生蛋白質(zhì)的原生橋連模式。在 一個(gè)實(shí)施例中，環(huán)狀基于毒素的治療性蛋白質(zhì)包括線性基于毒素的治療性蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì) 連接基團(tuán)，其中線性基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的N端和C端經(jīng)蛋白質(zhì)連接基團(tuán)連接形成酰胺 環(huán)狀蛋白質(zhì)主鏈。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)連接基團(tuán)包括選自Gly、Ala以及其組合的氨基 酸。
[0091] 可以向本文所述的的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)應(yīng)用多種環(huán)化方法。本文所述的基 于毒素的治療性蛋白質(zhì)容易使用B0C化學(xué)試劑環(huán)化以引入Ala、Gly或Ala/Gly橋，以及其組 合或其它殘基，如施納則（Schnolzer)等人，國(guó)際肽和蛋白質(zhì)研究雜志（Int J Pept Protein Res.)，40,180-193(1992)所述。環(huán)狀基于毒素的治療性蛋白質(zhì)可提高其穩(wěn)定性、 口服生物可用性，并且降低對(duì)蛋白分解的敏感性，而不影響基于毒素的治療性蛋白質(zhì)對(duì)其 特異性目標(biāo)的親和力。
[0092] 本文所披露的各基于毒素的治療性蛋白質(zhì)還可包括在任何位置添加、缺失、停止 位置、取代、替代、結(jié)合、關(guān)聯(lián)或排列，包括本文所披露的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)序列的位 置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59或60。因此，在具體實(shí)施例中，各基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的各氨基酸 位置可以是Xaa位置，其中Xaa表示在具體位置處氨基酸的添加、缺失、停止位置、取代、替 代、結(jié)合、關(guān)聯(lián)或排列。在具體實(shí)施例中，各基于毒素的治療性蛋白質(zhì)在位置1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59 或 60 的一或多者處具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個(gè)父&3位置。
[0093] 基于毒素的治療性蛋白質(zhì)可具有超過(guò)一種改變（添加、缺失、停止位置、取代、替 代、結(jié)合、關(guān)聯(lián)或排列)并且作為變異體、D-取代類(lèi)似物、羧基末端酰胺、修飾物和/或衍生物 中的一或多者合適。也就是說(shuō)，納入一種類(lèi)別的變異體、D-取代類(lèi)似物、羧基末端酰胺、修飾 物、和/或衍生物并不排除納入其它類(lèi)別并且在本文全部統(tǒng)稱(chēng)為"基于毒素的治療性蛋白 質(zhì)"。一個(gè)實(shí)例包括SEQ ID N0:1，其中位置21處的氨基酸為Nle和/或位置22處的氨基酸置 換成二氨基丙酸。
[0094]在位置21為Me t的任何蛋白質(zhì)中，Me t可以經(jīng)取代以賦予針對(duì)氧化的穩(wěn)定作用。在 一個(gè)實(shí)施例中，位置21處的Met經(jīng)Nle取代。在位置21處具有Met的SEQ ID N0:1-256中的任 一者中，這一Met可以經(jīng)Nle取代。在位置22處具有Lys的SEQ ID NO: 1-256中的任一者中，這 一Lys可以經(jīng)二氨基丙酸取代。因此，本文所披露的一個(gè)實(shí)施例包括SEQ ID N0:1，其中位置 21處的Met經(jīng)Nle取代，酰胺存在于C端和/或陰離子型部分存在于N端。
[0095] "非官能性氨基酸殘基"指的是D-或L-形式的氨基酸殘基，其具有缺乏酸性、堿性 或芳香族基團(tuán)的側(cè)鏈。示范性非官能性氨基酸殘基包括Meg、Gly、Ala、Val、Il e、Lei^PNle。
[0096] 在本文所披露的具體實(shí)施例中，治療性蛋白質(zhì)具有至少20個(gè)氨基酸、至少21個(gè)氨 基酸、至少22個(gè)氨基酸、至少23個(gè)氨基酸、至少24個(gè)氨基酸、至少25個(gè)氨基酸、至少26個(gè)氨基 酸、至少27個(gè)氨基酸、至少28個(gè)氨基酸、至少29個(gè)氨基酸、至少30個(gè)氨基酸、至少31個(gè)氨基 酸、至少32個(gè)氨基酸、至少33個(gè)氨基酸、至少34個(gè)氨基酸、至少35個(gè)氨基酸、至少36個(gè)氨基 酸、至少37個(gè)氨基酸、至少38個(gè)氨基酸、至少39個(gè)氨基酸、至少40個(gè)氨基酸、至少41個(gè)氨基 酸、至少42個(gè)氨基酸、至少43個(gè)氨基酸、至少44個(gè)氨基酸、至少45個(gè)氨基酸、至少46個(gè)氨基 酸、至少47個(gè)氨基酸、至少48個(gè)氨基酸、至少49個(gè)氨基酸、至少50個(gè)氨基酸、至少51個(gè)氨基 酸、至少52個(gè)氨基酸、至少53個(gè)氨基酸、至少54個(gè)氨基酸、至少55個(gè)氨基酸、至少56個(gè)氨基 酸、至少57個(gè)氨基酸、至少58個(gè)氨基酸、至少59個(gè)氨基酸、至少60個(gè)氨基酸、至少61個(gè)氨基 酸、至少62個(gè)氨基酸、至少63個(gè)氨基酸、至少64個(gè)氨基酸、至少65個(gè)氨基酸、至少66個(gè)氨基 酸、至少67個(gè)氨基酸、至少68個(gè)氨基酸、至少69個(gè)氨基酸、至少70個(gè)氨基酸、至少71個(gè)氨基 酸、至少72個(gè)氨基酸、至少73個(gè)氨基酸、至少74個(gè)氨基酸、至少75個(gè)氨基酸、至少76個(gè)氨基 酸、至少77個(gè)氨基酸、至少78個(gè)氨基酸、至少79個(gè)氨基酸或至少80個(gè)氨基酸。
[0097]在額外實(shí)施例中，治療性蛋白質(zhì)具有20個(gè)氨基酸、21個(gè)氨基酸、22個(gè)氨基酸、23個(gè) 氨基酸、24個(gè)氨基酸、25個(gè)氨基酸、26個(gè)氨基酸、27個(gè)氨基酸、28個(gè)氨基酸、29個(gè)氨基酸、30個(gè) 氨基酸、31個(gè)氨基酸、32個(gè)氨基酸、33個(gè)氨基酸、34個(gè)氨基酸、35個(gè)氨基酸、36個(gè)氨基酸、37個(gè) 氨基酸、38個(gè)氨基酸、39個(gè)氨基酸、40個(gè)氨基酸、41個(gè)氨基酸、42個(gè)氨基酸、43個(gè)氨基酸、44個(gè) 氨基酸、45個(gè)氨基酸、46個(gè)氨基酸、47個(gè)氨基酸、48個(gè)氨基酸、49個(gè)氨基酸、50個(gè)氨基酸、51個(gè) 氨基酸、52個(gè)氨基酸、53個(gè)氨基酸、54個(gè)氨基酸、55個(gè)氨基酸、56個(gè)氨基酸、57個(gè)氨基酸、58個(gè) 氨基酸、59個(gè)氨基酸、60個(gè)氨基酸、61個(gè)氨基酸、62個(gè)氨基酸、63個(gè)氨基酸、64個(gè)氨基酸、65個(gè) 氨基酸、66個(gè)氨基酸、67個(gè)氨基酸、68個(gè)氨基酸、69個(gè)氨基酸、70個(gè)氨基酸、71個(gè)氨基酸、72個(gè) 氨基酸、73個(gè)氨基酸、74個(gè)氨基酸、75個(gè)氨基酸、76個(gè)氨基酸、77個(gè)氨基酸、78個(gè)氨基酸、79個(gè) 氨基酸或80個(gè)氨基酸。
[0098]在本文所披露的額外實(shí)施例中，治療性蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)二硫橋鍵、至少兩個(gè) 二硫橋鍵、至少三個(gè)二硫橋鍵、至少四個(gè)二硫橋鍵或至少五個(gè)二硫橋鍵。
[0099]在額外實(shí)施例中，治療性蛋白質(zhì)具有一個(gè)二硫橋鍵、兩個(gè)二硫橋鍵、三個(gè)二硫橋 鍵、四個(gè)二硫橋鍵或五個(gè)二硫橋鍵。
[0100] 治療性蛋白質(zhì)還適用于本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物中，包括分子量介于500和50， 000道爾頓之間的那些。
[0101] 具體來(lái)說(shuō)，相關(guān)治療性蛋白質(zhì)包括對(duì)例如Na+、K+或Ca2+通道的陽(yáng)離子通道、例如cr 通道的陰離子通道或例如煙堿乙酰基膽堿受體(NAChR)的配位體門(mén)控性通道起作用的那 些。這些通道包括胞外和/或胞內(nèi)存在的配位體和電壓門(mén)控性離子通道。胞外通道或受體包 括kanate;a-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA);N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和乙 酰膽堿受體(例如a9/al0亞型(nAChR));血清素(5-羥色胺，5-HT)受體；以及甘氨酸和y-丁 酸(GABA)受體。胞內(nèi)受體可包括環(huán)狀A(yù)MP (cAMP)、環(huán)狀GMP (cGMP)、Ca2+以及G-蛋白受體。 [0102]適用于本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的治療性蛋白質(zhì)的具體實(shí)例包括靶向電壓門(mén) 控性通道的毒素蛋白質(zhì)，包括ShK蛋白質(zhì)。示范性電壓門(mén)控性通道包括Kv 1.1、Kv 1.2、Kv 1.3、 Kvl.4、Kvl.5、Kvl.6、Kvl.7、Kv2.1、Kv3.1、Kv3.2、Kvll.l、Kcl.l、Kc2.1、Kc3.1、Navl.2、 Navi. 4以及Cavl. 2通道。
[0103] 還可以使用本文所述的治療性蛋白質(zhì)的前藥。術(shù)語(yǔ)"前藥"指的是在受試者體內(nèi)可 發(fā)生生物轉(zhuǎn)化(例如自發(fā)或酶促）以釋放或轉(zhuǎn)化(例如酶促、機(jī)械、電磁等）蛋白質(zhì)的一或多 種活性形式的治療性蛋白質(zhì)。前藥可用于克服與穩(wěn)定性、毒性、缺乏特異性或生物可用性有 限有關(guān)的問(wèn)題。示范性前藥包括活性蛋白質(zhì)和化學(xué)掩蔽基團(tuán)（例如可逆地抑制蛋白質(zhì)活性 的基團(tuán)）。一些優(yōu)選前藥為序列在代謝條件下可裂解的蛋白質(zhì)的變異體或修飾物。示范性前 藥在發(fā)生生物化學(xué)轉(zhuǎn)型(例如磷酸化、氫化、脫氫、糖基化等)時(shí)在體內(nèi)或體外變得具有活性 或更具活性。前藥通常提供溶解度、組織相容性或延時(shí)釋放的優(yōu)勢(shì)（參看例如邦德高 (Bundgard),前藥設(shè)計(jì)（Design of Prodrugs),第 7-9 頁(yè)，第 21-24 頁(yè)，埃爾塞維爾 (Elsevier)，阿姆斯特丹(Amsterdam)(1985);以及西爾弗曼(Silverman)，藥物設(shè)計(jì)和藥物 作用的有機(jī)化學(xué)方法（The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action),第 352-401頁(yè)，學(xué)術(shù)出版社（Academic Press)，圣地亞哥（San Diego)，加利福尼亞州（CA) (1992))。
[0104] 因?yàn)樗苄苑N類(lèi)的上述治療性蛋白質(zhì)當(dāng)投予到基于水的媒劑中時(shí)時(shí)發(fā)生初始爆 發(fā)，所以適宜使用此類(lèi)水溶性種類(lèi)的本文所披露的基于PLG的儲(chǔ)槽式調(diào)配物。此類(lèi)蛋白質(zhì)的 辛醇-水分配系數(shù)(Kow)為1或更低，但大于0.1。蛋白質(zhì)可以調(diào)配成鹽形式，當(dāng)分子具有例如 氨基殘基的堿性基團(tuán)時(shí)尤其如此。鹽形式可以是酸(例如鹽酸、硫酸、硝酸)和有機(jī)酸(例如 碳酸和丁二酸)的加成物。
[0105]本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物使用的治療性蛋白質(zhì)還可以經(jīng)分子工程改造以顯示 穩(wěn)固酸穩(wěn)定性。具體來(lái)說(shuō)，可以進(jìn)行C端酰胺化(不可氧化的Nle取代)和/或N端處的不可水 解的L-磷酸酪氨酸取代以根據(jù)其在儲(chǔ)槽式調(diào)配物中將經(jīng)受的酸性微環(huán)境和生理環(huán)境調(diào)適 治療性蛋白質(zhì)。
[0106]治療性蛋白質(zhì)的適當(dāng)量取決于蛋白質(zhì)種類(lèi)，但以?xún)?chǔ)槽式調(diào)配物中所用的可生物降 解聚合物的組成計(jì)，一般降到0.001重量％到90重量％范圍內(nèi)。額外實(shí)施例包括0.002重 量％、0.003重量％、0.004重量％、0.005重量％、0.006重量％、0.007重量％、0.008重量％、 0.009重量％、0.01重量％、0.02重量％、0.03重量％、0.04重量％、0.05重量％、0.06重 量％、0.07重量％、0.08重量％、0.09重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重 量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1重量％、2重量％、3重 量％、4重量％、5重量％、6重量％、7重量％、8重量％、9重量％或10重量％。
[0107]形成儲(chǔ)槽式調(diào)配物的方法.關(guān)于制造本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的實(shí)例的方法， 可采用用于包覆治療性蛋白質(zhì)的任何已知微囊封程序，包括水中干燥法、噴霧干燥法、凝聚 法或其等效方法。
[0108]在具體實(shí)施例中，水溶性或可分散性治療性蛋白質(zhì)可以與賦形劑（例如鹽、緩沖 劑、多元醇、糖、氨基酸、表面活性劑、穩(wěn)定劑)和釋放改性劑組合并且與聚合物和溶劑混合 形成多相系統(tǒng)，所述系統(tǒng)可通過(guò)均質(zhì)化、噴霧干燥、凝聚、超聲波處理和/或微流體化機(jī)械地 轉(zhuǎn)化成微乳液。這一初級(jí)水/油(《/〇)乳液接著可添加到包括例如表面活性劑的穩(wěn)定劑和緩 沖劑的水性連續(xù)相中，并且進(jìn)一步分散形成具有聚合物粒子的水包油包水(w/o/w)乳液，所 述乳液通過(guò)溶劑蒸發(fā)損失和攪拌/混合而隨時(shí)間硬化或熟化。
[0109] 水性懸浮液可以通過(guò)使用例如離心分離的方法進(jìn)一步濃縮以增濃較高密度相(主 要聚合物粒子），隨后去除上部(澄清或略混濁）溶液層達(dá)到適當(dāng)最終體積，實(shí)現(xiàn)所要濃度。 這一方法還可以用于使外部水相呈所要pH、容積滲透濃度、離子強(qiáng)度和緩沖劑組成。以類(lèi)似 方式，懸浮液可進(jìn)一步稀釋成包括生理食鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、糖溶液、鹽、緩沖劑和其它 賦形劑的水性組合物以實(shí)現(xiàn)所要濃度（固體重量百分比、PH、容積滲透濃度或總藥物劑量） 或稀釋到賦形劑中用于冷凍-干燥(凍干)步驟或額外處理。
[0110] 如以下實(shí)例中進(jìn)一步描述，治療性蛋白質(zhì)可以在水中溶解達(dá)到最終所要濃度并且 和緩沖劑鹽和包括表面活性劑的賦形劑一起溶解。完全w/o乳液可以倒入培養(yǎng)基瓶中；向瓶 中裝入20mL 0.5 %DSS、20mM磷酸鹽pH 7.0、0.05 % PVA水溶液?；旌衔锟梢杂眉羟性O(shè)置(26， 〇〇〇轉(zhuǎn)/分鐘(rpm))均質(zhì)化5分鐘，使瓶與熔融的冰(0°C)熱接觸。產(chǎn)生劑探針可以保持浸沒(méi) 以限制液體發(fā)泡和溢出。乳液將變成乳白色(類(lèi)似于1%牛奶）?？梢詼y(cè)試pH并且根據(jù)需要調(diào) 整到范圍5〈pH〈7.5中?？梢詮募羟腥コ{(diào)配物并且松散地蓋蓋子以減緩蒸發(fā)，并且在室溫 下在通風(fēng)櫥中攪拌隔夜以使溶劑蒸發(fā)(二氯甲烷）?？山又ㄟ^(guò)篩網(wǎng)過(guò)濾調(diào)配物。乳液可以 儲(chǔ)存于室溫下，溫和的上下顛倒混合以避免沉降/結(jié)塊?；蛘?，溶液可以?xún)?chǔ)存在4°C或?yàn)榱溯^ 長(zhǎng)存放穩(wěn)定性而凍干。所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知許多適當(dāng)凍干技術(shù)。
[0111] 使用方法.本文所披露的方法包括用本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物治療受試者（人 類(lèi)、獸醫(yī)學(xué)動(dòng)物(犬、貓、爬蟲(chóng)、鳥(niǎo)類(lèi)等）、家畜（馬、牛、山羊、豬、雞等)和研究動(dòng)物(猴、大鼠、 小鼠、魚(yú)等））以實(shí)現(xiàn)治療性蛋白質(zhì)、其鹽或前藥的持續(xù)釋放。持續(xù)釋放可向受試者傳遞治療 有效量的治療性蛋白質(zhì)、其鹽或前藥。治療有效量包括提供有效量或有效含量(事先定義） 的那些量。
[0112] "有效量"為在受試者體內(nèi)產(chǎn)生所要生理學(xué)改變所必需的治療性蛋白質(zhì)的量。通常 為研究目的投予有效量。本文所披露的有效量減少、控制或消除免疫系統(tǒng)病癥的存在或活 性和/或減輕、控制或消除免疫系統(tǒng)病癥的非所要副作用。
[0113] "防治性治療"包括向不展現(xiàn)免疫系統(tǒng)病癥的病征或癥狀或僅展現(xiàn)免疫系統(tǒng)病癥 的早期病征或癥狀的受試者投予的治療，使得治療是為了減少、預(yù)防或降低免疫系統(tǒng)病癥 進(jìn)一步發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)而投予。因此，防治性治療充當(dāng)針對(duì)免疫系統(tǒng)病癥的預(yù)防性治療。
[0114] "治療性治療"包括向展現(xiàn)免疫系統(tǒng)病癥的癥狀或病征的受試者投予的治療并且 為了減少或消除免疫系統(tǒng)病癥的那些病征或癥狀而向受試者投予。治療性治療可減輕、控 制或消除免疫系統(tǒng)病癥的存在或活性，和/或減輕、控制或消除免疫系統(tǒng)病癥的副作用。
[0115] 在具體實(shí)施例中，本文所披露的治療性蛋白質(zhì)調(diào)配成用于治療性治療免疫系統(tǒng)病 癥或病狀(包括自體免疫疾病）的儲(chǔ)槽式調(diào)配物。在某些實(shí)施例中，自體免疫疾病或病狀為 牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、IPEX、全身性紅斑性狼瘡癥、狼瘡腎炎、I型糖尿 病、II型糖尿病、艾迪森氏?。ˋddison's disease)、乳糜瀉、皮肌炎、葛瑞夫茲氏病 (Graves 'disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto 's thyroiditis)、重癥肌無(wú)力、惡性貧血、 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、伴有多血管炎的肉芽腫病(韋格納病(Wegener ' s di sease))、抗嗜中性白 細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)自體抗體(ANCA)血管炎、發(fā)炎性腸病、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、 過(guò)敏、哮喘、異位性皮炎、移植物抗宿主疾病、組織或器官移植、心血管疾病、血管炎、小血管 炎、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、葡萄膜炎、白塞氏綜合癥(Behcet's syndrome)、非酒精性脂肪肝病(包 括NASH)、自體免疫性肝病或休格連綜合癥(Sjogren syndrome)。
[0116] 在一示范性實(shí)施例中，免疫系統(tǒng)疾病為牛皮癬?？梢允褂冒ㄒ韵碌膮?shù)評(píng)估治 療的影響:斑塊體表面積受累(BSA%)、牛皮癬區(qū)域和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)組分和研究員牛 皮癬整體評(píng)定（IGA，5點(diǎn)等級(jí)）、患者牛皮癬整體評(píng)定、皮膚病生活質(zhì)量指數(shù)(DLQI)以及牛皮 癬失能指數(shù)(PDI)。治療對(duì)牛皮癬斑塊的影響可以通過(guò)使用包括以下的方法對(duì)注射后15天、 30天或更多天取的生物檢體進(jìn)行評(píng)估來(lái)測(cè)定：由病理學(xué)家對(duì)斑塊組織病理學(xué)進(jìn)行H&E染色 和評(píng)估;促炎性細(xì)胞因子的qPCR的基因表達(dá)，包括:IFNy、TNFa、iN0S、IL_4、8、10、17A、17F、 17八作、20、21、22、23、0(^20、牛皮癬素、1(16和其它細(xì)胞激素 ;細(xì)胞活化/群體(10^16和燈67) 的免疫組織化學(xué)表征;和/或測(cè)量單核細(xì)胞浸潤(rùn)(CD3、HLA-DR、CDllc+、CD68、CD163、Kvl.3)。
[0117] 在另一實(shí)施例中，可以使用所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)通過(guò)測(cè)量的參數(shù)評(píng)估疾病期間 對(duì)全身性自體免疫/發(fā)炎狀態(tài)的作用，包括:測(cè)量血漿/血清生物標(biāo)記物，包括IL-17A、IL-17F、IL-17A/F和其它細(xì)胞激素/趨化因子;全血總RNA中的基因表達(dá);和/或分析周邊血液?jiǎn)?核細(xì)胞群體(CD4+T細(xì)胞:原生中央記憶體或效應(yīng)記憶T細(xì)胞;CD8+T細(xì)胞:原生中央記憶體或 效應(yīng)記憶T細(xì)胞;調(diào)節(jié)T細(xì)胞）。
[0118] 對(duì)于投予，可以基于體外分析法和/或動(dòng)物模型研究的結(jié)果初始地估算"治療有效 量"（在本文中也稱(chēng)為劑量）。這類(lèi)信息可以用于更準(zhǔn)確地判定適用于所關(guān)注受試者的劑量。
[0119] 儲(chǔ)槽式調(diào)配物中治療性蛋白質(zhì)的量和濃度以及向受試者投予的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的 量可以由醫(yī)生、獸醫(yī)或研究人員基于臨床上相關(guān)因素、儲(chǔ)槽式調(diào)配物中的治療性蛋白質(zhì)的 溶解度、治療性蛋白質(zhì)的效能和活性以及儲(chǔ)槽式調(diào)配物投予方式來(lái)選擇?？梢韵蚴茉囌咄?予包括治療有效量的本文所披露的治療性蛋白質(zhì)或其醫(yī)藥學(xué)上可接受的鹽或前藥的儲(chǔ)槽 式調(diào)配物以臨床上安全和有效的方式(包括一或多次獨(dú)立投予儲(chǔ)槽式調(diào)配物)治療自體免 疫疾病。在其它考慮因素中，每次投予劑量的量和投予的總量還可以取決于受試者(包括目 標(biāo))的身體、生理學(xué)和心理因素、體重、病狀嚴(yán)重程度、自體免疫疾病類(lèi)型、事先或同時(shí)發(fā)生 的治療性干預(yù)、受試者的自發(fā)病以及投予途徑。
[0120] 適用劑量通常在0.1到40,000yg/kg或0.5到lyg/kg范圍內(nèi)。在其它實(shí)例中，適用劑 量通?？稍? ? 1 到 lyg/kg、0 ? 1 到 1 Oyg/kg、0 ? 1 到 100yg/kg、0 ? 1 到 1，000yg/kg、0 ? 1 到 10，000y g/kg、0.1到20，000iig/kg、1到lOyg/kg、1到 100iig/kg、1到 1，000iig/kg、1到 10,000iig/kg、l到 20，000yg/kg、1到30，000yg/kg、10到100yg/kg、10到1，000yg/kg、10到10，000yg/kg、10到 20,000yg/kg、l(^lj30,000yg/kg、10(^ljl，000yg/kg、10(^ljl0,000yg/kg、10(^lj20,000yg/ kg、100到30，000yg/kg、1，000到10，000yg/kg、1，000到20，000yg/kg、1，000到30，000yg/kg、 10，000到20，000yg/kg、10，000到30，000yg/kg或20，000到30，000yg/kg范圍內(nèi)。在其它實(shí)例 中，劑量可包括〇? lyg/kg、lyg/kg、5iig/kg、10iig/kg、15yg/kg、20iig/kg、25iig/kg、30iig/kg、 35yg/kg、40iig/kg、45yg/kg、50iig/kg、55yg/kg、60iig/kg、65yg/kg、70iig/kg、75yg/kg、80iig/ kg、85yg/kg、90iig/kg、95yg/kg、100iig/kg、150iig/kg、200iig/kg、250iig/kg、350iig/kg、400ii g/kg、450iig/kg、500iig/kg、550iig/kg、600iig/kg、650iig/kg、700iig/kg、750iig/kg、800iig/kg、 850iig/kg、900iig/kg、950iig/kg、1，000iig/kg、1，500iig/kg、2，000iig/kg、2，500iig/kg、3，000ii g/kg、3，500iig/kg、4，000iig/kg、4，500iig/kg、5，000iig/kg、5，500iig/kg、6，000iig/kg、6，500ii g/kg、7，000iig/kg、7，500iig/kg、8，000iig/kg、8，500iig/kg、9，000iig/kg、9，500iig/kg、10，000 yg/kg、10，500iig/kg、11，000iig/kg、11，500iig/kg、12，000iig/kg、12，500iig/kg、13，OOOiig/ kg、13，500iig/kg、14，OOOlig/kg、14，500iig/kg、15，OOOlig/kg、15，500iig/kg、16，OOOlig/kg、 16，500iig/kg、17，OOOlig/kg、17，500iig/kg、18，OOOlig/kg、18，500iig/kg、19，OOOlig/kg、19， 500iig/kg、20，OOOlig/kg、20，500iig/kg、21，OOOlig/kg、21，500iig/kg、22，OOOlig/kg、22，500ii g/kg、23，OOOlig/kg、23，500iig/kg、24，OOOlig/kg、24，500iig/kg、25，OOOlig/kg、25，500iig/kg、 26，OOOlig/kg、26，500iig/kg、27，OOOlig/kg、27，500iig/kg、28，OOOlig/kg、28，500iig/kg、29， OOOyg/kg、29，500iig/kg、30，OOOlig/kg、30，500iig/kg、31，OOOlig/kg、31，500iig/kg、32，OOOy g/kg、32，500iig/kg、33，OOOlig/kg、33，500iig/kg、34，OOOlig/kg、34，500iig/kg、35，OOOlig/kg、 35，500iig/kg、36，OOOlig/kg、36，500iig/kg、37，OOOlig/kg、37，500iig/kg、38，OOOlig/kg、38， 500iig/kg、39，OOOlig/kg、39，500iig/kg 或 40，OOOlig/kg。
[0121 ]在其它實(shí)例中劑量可包括 lmg/kg、5mg/kg、lOmg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、 30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/ kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg、lOOmg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、350mg/ kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、750mg/kg、 800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1 OOOmg/kg 或更高。
[0122] 可以通過(guò)在治療方案的時(shí)程期間投予單次或多次劑量(例如每周、每2周、每3周、 每個(gè)月、每2個(gè)月、每3個(gè)月、每4個(gè)月、每5個(gè)月、每6個(gè)月、每7個(gè)月、每8個(gè)月、每9個(gè)月、每10個(gè) 月、每11個(gè)月或每年)實(shí)現(xiàn)治療有效量。在具體實(shí)施例中，僅需要單次投予。在額外實(shí)施例 中，每30天或每60天提供投予。
[0123] 關(guān)于本文所披露的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的適當(dāng)使用方法的額外信息見(jiàn)于國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng) 案第?(^/1^2014/020771號(hào)和第?(^/1]52014/047691號(hào)，以及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案第14/124,669 號(hào)中。
[0124] 儲(chǔ)槽式調(diào)配物可以通過(guò)任何適當(dāng)途徑投予，包括注射;非經(jīng)腸注射;滴注；或通過(guò) 細(xì)針用注射植入到軟組織、體腔或偶爾植入到血管中。
[0125] 實(shí)例.包括以下實(shí)例以展示本發(fā)明的具體實(shí)施例。所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員鑒于本 發(fā)明應(yīng)了解可以對(duì)本文所披露的具體實(shí)施例作出許多改變并且仍獲得同樣或類(lèi)似結(jié)果而 不脫離本發(fā)明的精神和范圍。
[0126] 1. -種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其包括：（i)包括治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)部水相，所述治療性蛋 白質(zhì)以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.025重量％到5重量％存在；（ii)基于聚合物的固體/油相；以 及(iii)分散有粒子的外部水相，所述外部水相包括以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的〇.〇1重量％到1 重量％的表面活性劑，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治 療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。
[0127] 2.實(shí)施例1的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物選自聚(丙交酯）、聚（乙交酯）、聚(丙 交酯-共-乙交酯）、聚(乳酸）、聚（乙醇酸）、聚(乳酸-共-乙醇酸）、聚(丙交酯-共-乙交酯-接 枝PEG)或其摻合物或共聚物。
[0128] 3.實(shí)施例1或2的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物是丙交酯：乙交酯比率為1:1的聚 (丙交酯-共_乙交酯）。
[0129] 4.實(shí)施例1、2或3中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)以所述儲(chǔ)槽式 調(diào)配物的0.025重量％ ;以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.25重量％ ;或以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物2.5重 量％存在。
[0130] 5.實(shí)施例1、2、3或4中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述表面活性劑選自聚山梨醇 酯、聚（乙二醇）、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷(PE0-PP0)摻合物、泊洛沙姆、SpanX、Brij?、二辛基-磺基丁二酸酯、聚（乙烯醇）（PVA)、PVP或其組合。
[0131] 6.實(shí)施例1、2、3、4或5中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有至少 20個(gè)氨基酸、至少21個(gè)氨基酸、至少22個(gè)氨基酸、至少23個(gè)氨基酸、至少24個(gè)氨基酸、至少25 個(gè)氨基酸、至少26個(gè)氨基酸、至少27個(gè)氨基酸、至少28個(gè)氨基酸、至少29個(gè)氨基酸、至少30個(gè) 氨基酸、至少31個(gè)氨基酸、至少32個(gè)氨基酸、至少33個(gè)氨基酸、至少34個(gè)氨基酸、至少35個(gè)氨 基酸、至少36個(gè)氨基酸、至少37個(gè)氨基酸、至少38個(gè)氨基酸、至少39個(gè)氨基酸、至少40個(gè)氨基 酸、至少41個(gè)氨基酸、至少42個(gè)氨基酸、至少43個(gè)氨基酸、至少44個(gè)氨基酸、至少45個(gè)氨基 酸、至少46個(gè)氨基酸、至少47個(gè)氨基酸、至少48個(gè)氨基酸、至少49個(gè)氨基酸、至少50個(gè)氨基 酸、至少51個(gè)氨基酸、至少52個(gè)氨基酸、至少53個(gè)氨基酸、至少54個(gè)氨基酸或至少55個(gè)氨基 酸。
[0132] 7.實(shí)施例1、2、3、4或5中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有20個(gè) 氨基酸、21個(gè)氨基酸、22個(gè)氨基酸、23個(gè)氨基酸、24個(gè)氨基酸、25個(gè)氨基酸、26個(gè)氨基酸、27個(gè) 氨基酸、28個(gè)氨基酸、29個(gè)氨基酸、30個(gè)氨基酸、31個(gè)氨基酸、32個(gè)氨基酸、33個(gè)氨基酸、34個(gè) 氨基酸、35個(gè)氨基酸、36個(gè)氨基酸、37個(gè)氨基酸、38個(gè)氨基酸、39個(gè)氨基酸、40個(gè)氨基酸、41個(gè) 氨基酸、42個(gè)氨基酸、43個(gè)氨基酸、44個(gè)氨基酸、45個(gè)氨基酸、46個(gè)氨基酸、47個(gè)氨基酸、48個(gè) 氨基酸、49個(gè)氨基酸、50個(gè)氨基酸、51個(gè)氨基酸、52個(gè)氨基酸、53個(gè)氨基酸、54個(gè)氨基酸或55 個(gè)氨基酸。
[0133] 8.實(shí)施例1、2、3、4、5、6或7中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有 至少一個(gè)二硫橋鍵、至少兩個(gè)二硫橋鍵、至少三個(gè)二硫橋鍵、至少四個(gè)二硫橋鍵或至少五個(gè) 二硫橋鍵。
[0134] 9.實(shí)施例1、2、3、4、5、6或7中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有 一個(gè)二硫橋鍵、兩個(gè)二硫橋鍵、三個(gè)二硫橋鍵、四個(gè)二硫橋鍵或五個(gè)二硫橋鍵。
[0135] 10.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白 質(zhì)為基于毒素的治療性蛋白質(zhì)。
[0136] 11.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋 白質(zhì)為基于ShK的蛋白質(zhì)。
[0137] 12.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療 性蛋白質(zhì)是抑制電壓門(mén)控性鉀通道的基于ShK的蛋白質(zhì)。
[0138] 13.實(shí)施例12的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述抑制的電壓門(mén)控性鉀通道為Kvl.l、 Kvl ? 3、Kvl ? 5、Kvl ? 3/1 ? 5、Kvl ? 6、Kv3? 2或KCa3? 1 通道中的一或多者。
[0139] 14.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所 述治療性蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 1-260中任一者的序列。
[0140] 15.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中 所述治療性蛋白質(zhì)具有3￡〇10從) ：1-224或3￡〇10從):257-260中任一者的序列。
[0141] 16.實(shí)施例 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物， 其中所述治療性蛋白質(zhì)為以下中的一或多個(gè):SEQ ID N0:208、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0: 257、SEQ ID N0:210、SEQ ID N0:219、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:221、SEQ ID N0:258、SEQ ID NO:259、SEQ ID NO:260或其鹽。
[0142] 17.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配 物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為SEQ ID N0:217或SEQ ID N0:218。
[0143] 18.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15或16中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物， 其中所述治療性蛋白質(zhì)為SEQ ID NO:210。
[0144] 19.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽 式調(diào)配物，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì) 至少40天、在單次投予后持續(xù)釋放至少41天、在單次投予后持續(xù)釋放至少42天、在單次投予 后持續(xù)釋放至少43天、在單次投予后持續(xù)釋放至少44天、在單次投予后持續(xù)釋放至少45天、 在單次投予后持續(xù)釋放至少46天、在單次投予后持續(xù)釋放至少47天、在單次投予后持續(xù)釋 放至少48天、在單次投予后持續(xù)釋放至少49天、在單次投予后持續(xù)釋放至少50天、在單次投 予后持續(xù)釋放至少51天、在單次投予后持續(xù)釋放至少52天、在單次投予后持續(xù)釋放至少53 天、在單次投予后持續(xù)釋放至少54天、在單次投予后持續(xù)釋放至少55天或在單次投予后持 續(xù)釋放至少56天。
[0145] 20.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽 式調(diào)配物，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì) 40天、在單次投予后持續(xù)釋放41天、在單次投予后持續(xù)釋放42天、在單次投予后持續(xù)釋放43 天、在單次投予后持續(xù)釋放44天、在單次投予后持續(xù)釋放45天、在單次投予后持續(xù)釋放46 天、在單次投予后持續(xù)釋放47天、在單次投予后持續(xù)釋放48天、在單次投予后持續(xù)釋放49 天、在單次投予后持續(xù)釋放50天、在單次投予后持續(xù)釋放51天、在單次投予后持續(xù)釋放52 天、在單次投予后持續(xù)釋放53天、在單次投予后持續(xù)釋放54天、在單次投予后持續(xù)釋放55天 或在單次投予后持續(xù)釋放56天。
[0146] 21.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中任一項(xiàng)的儲(chǔ) 槽式調(diào)配物，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白 質(zhì)至少兩個(gè)月。
[0147] 22.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽 式調(diào)配物，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì) 兩個(gè)月。
[0148] 23.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或21中任一項(xiàng) 的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性 蛋白質(zhì)至少三個(gè)月。
[0149] 24.實(shí)施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中任一項(xiàng)的儲(chǔ) 槽式調(diào)配物，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白 質(zhì)三個(gè)月。
[0150] 25.-種凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其包括：（i)基于聚合物的外部固體/油相，其包括以 所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物計(jì)0.025重量％到5重量％分散于其中的治療性蛋白質(zhì)；（ii)以所述 凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物計(jì)0.01重量％到〇.5重量％表面活性劑；以及（iii)以所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào) 配物計(jì)0.5重量％到90重量％糖，其中在所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物復(fù)原后，所述復(fù)原的儲(chǔ)槽式 調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。
[0151 ] 26.實(shí)施例25的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述糖為蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、右旋糖 或其組合。
[0152] 27.實(shí)施例25或26的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述糖為蔗糖。
[0153] 28.實(shí)施例25、26或27中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物選自聚（丙 交酯）、聚（乙交酯）、聚(丙交酯-共-乙交酯）、聚(乳酸）、聚（乙醇酸）、聚（乳酸-共-乙醇酸）、 聚(丙交酯-共_乙交酯-接枝PEG)或其摻合物或共聚物。
[0154] 29.實(shí)施例25、26、27或28中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物是丙交 酯：乙交酯比率為1:1的聚(丙交酯-共-乙交酯）。
[0155] 30.實(shí)施例25、26、27、28或29中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白 質(zhì)以所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.025重量％;以所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.25重量％;或以 所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物的2.5重量％存在。
[0156] 31.實(shí)施例25、26、27、28、29或30中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述表面活 性劑選自聚山梨醇酯、聚（乙二醇）、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷摻合物、泊洛沙姆、Span?.. Brij?、 二辛基-磺基丁二酸鹽、PVA、PVP或其組合。
[0157] 32.實(shí)施例25、26、27、28、29、30或31中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療 性蛋白質(zhì)具有至少20個(gè)氨基酸、至少21個(gè)氨基酸、至少22個(gè)氨基酸、至少23個(gè)氨基酸、至少 24個(gè)氨基酸、至少25個(gè)氨基酸、至少26個(gè)氨基酸、至少27個(gè)氨基酸、至少28個(gè)氨基酸、至少29 個(gè)氨基酸、至少30個(gè)氨基酸、至少31個(gè)氨基酸、至少32個(gè)氨基酸、至少33個(gè)氨基酸、至少34個(gè) 氨基酸、至少35個(gè)氨基酸、至少36個(gè)氨基酸、至少37個(gè)氨基酸、至少38個(gè)氨基酸、至少39個(gè)氨 基酸、至少40個(gè)氨基酸、至少41個(gè)氨基酸、至少42個(gè)氨基酸、至少43個(gè)氨基酸、至少44個(gè)氨基 酸、至少45個(gè)氨基酸、至少46個(gè)氨基酸、至少47個(gè)氨基酸、至少48個(gè)氨基酸、至少49個(gè)氨基 酸、至少50個(gè)氨基酸、至少51個(gè)氨基酸、至少52個(gè)氨基酸、至少53個(gè)氨基酸、至少54個(gè)氨基酸 或至少55個(gè)氨基酸。
[0158] 33.實(shí)施例25、26、27、28、29、30或31中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療 性蛋白質(zhì)具有20個(gè)氨基酸、21個(gè)氨基酸、22個(gè)氨基酸、23個(gè)氨基酸、24個(gè)氨基酸、25個(gè)氨基 酸、26個(gè)氨基酸、27個(gè)氨基酸、28個(gè)氨基酸、29個(gè)氨基酸、30個(gè)氨基酸、31個(gè)氨基酸、32個(gè)氨基 酸、33個(gè)氨基酸、34個(gè)氨基酸、35個(gè)氨基酸、36個(gè)氨基酸、37個(gè)氨基酸、38個(gè)氨基酸、39個(gè)氨基 酸、40個(gè)氨基酸、41個(gè)氨基酸、42個(gè)氨基酸、43個(gè)氨基酸、44個(gè)氨基酸、45個(gè)氨基酸、46個(gè)氨基 酸、47個(gè)氨基酸、48個(gè)氨基酸、49個(gè)氨基酸、50個(gè)氨基酸、51個(gè)氨基酸、52個(gè)氨基酸、53個(gè)氨基 酸、54個(gè)氨基酸或55個(gè)氨基酸。
[0159] 34.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32或33中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所 述治療性蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)二硫橋鍵、至少兩個(gè)二硫橋鍵、至少三個(gè)二硫橋鍵、至少四個(gè) 二硫橋鍵或至少五個(gè)二硫橋鍵。
[0160] 35.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32或33中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所 述治療性蛋白質(zhì)具有一個(gè)二硫橋鍵、兩個(gè)二硫橋鍵、三個(gè)二硫橋鍵、四個(gè)二硫橋鍵或五個(gè)二 硫橋鍵。
[0161] 36.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物， 其中所述治療性蛋白質(zhì)為基于毒素的治療性蛋白質(zhì)。
[0162] 37.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物， 其中所述治療性蛋白質(zhì)為基于ShK的蛋白質(zhì)。
[0163] 38.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物， 其中所述治療性蛋白質(zhì)為抑制電壓門(mén)控性鉀通道的基于ShK的蛋白質(zhì)。
[0164] 39.實(shí)施例38的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述抑制的電壓門(mén)控性鉀通道為Kvl.l、 Kvl ? 3、Kvl ? 5、Kvl ? 3/1 ? 5、Kvl ? 6、Kv3 ? 2或KCa3 ? 1 通道。
[0165] 40.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39中任一項(xiàng)的凍干 儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 1-260中任一者的序列。
[0166] 41.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40中任一項(xiàng)的凍 干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有3￡〇10勵(lì) ：1-224或3￡〇10勵(lì):257-260中任 一者的序列。
[0167] 42.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41中任一項(xiàng) 的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為SEQ ID N0:208、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:257、SEQ ID N0:210、SEQ ID N0:219、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:221 或其鹽。
[0168] 43.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中任一 項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述復(fù)原的儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋 放所述治療性蛋白質(zhì)至少40天、在單次投予后持續(xù)釋放至少41天、在單次投予后持續(xù)釋放 至少42天、在單次投予后持續(xù)釋放至少43天、在單次投予后持續(xù)釋放至少44天、在單次投予 后持續(xù)釋放至少45天、在單次投予后持續(xù)釋放至少46天、在單次投予后持續(xù)釋放至少47天、 在單次投予后持續(xù)釋放至少48天、在單次投予后持續(xù)釋放至少49天、在單次投予后持續(xù)釋 放至少50天、在單次投予后持續(xù)釋放至少51天、在單次投予后持續(xù)釋放至少52天、在單次投 予后持續(xù)釋放至少53天、在單次投予后持續(xù)釋放至少54天、在單次投予后持續(xù)釋放至少55 天或在單次投予后持續(xù)釋放至少56天。
[0169] 44.實(shí)施例 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中任一 項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述復(fù)原儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放 所述治療性蛋白質(zhì)40天、在單次投予后持續(xù)釋放41天、在單次投予后持續(xù)釋放42天、在單次 投予后持續(xù)釋放43天、在單次投予后持續(xù)釋放44天、在單次投予后持續(xù)釋放45天、在單次投 予后持續(xù)釋放46天、在單次投予后持續(xù)釋放47天、在單次投予后持續(xù)釋放48天、在單次投予 后持續(xù)釋放49天、在單次投予后持續(xù)釋放50天、在單次投予后持續(xù)釋放51天、在單次投予后 持續(xù)釋放52天、在單次投予后持續(xù)釋放53天、在單次投予后持續(xù)釋放54天、在單次投予后持 續(xù)釋放55天或在單次投予后持續(xù)釋放56天。
[0170] 45.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43中 任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述復(fù)原儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù) 釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少兩個(gè)月。
[0171] 46.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中任一 項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述復(fù)原儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放 所述治療性蛋白質(zhì)兩個(gè)月。
[0172] 47.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或45 中任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述復(fù)原儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持 續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少三個(gè)月。
[0173] 48.實(shí)施例25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43中 任一項(xiàng)的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述復(fù)原儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù) 釋放所述治療性蛋白質(zhì)三個(gè)月。
[0174] 49. -種治療患有自體免疫疾病的受試者的方法，其包括向所述受試者投予治療 有效量的實(shí)施例1到48中任一項(xiàng)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，由此治療所述受試者。
[0175] 50. -種治療患有自體免疫疾病的受試者的方法，其包括投予治療有效量的儲(chǔ)槽 式調(diào)配物，所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物包括以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的〇.〇. 25重量％到5重量％存在的 分散有Kvl.3通道抑制劑蛋白質(zhì)的生物相容性聚合物，和以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.1重量％ 到1重量％存在的表面活性劑，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物不含改變Kvl.3通道抑制劑蛋白質(zhì)的 釋放速率的額外成分，由此治療所述受試者。
[0176] 51.實(shí)施例49或50的方法，其中所述自體免疫疾病為多發(fā)性硬化癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、狼瘡腎炎、器官移植排斥反應(yīng)、葡萄膜炎、干眼病或自體 免疫性腸病。
[0177] 52.實(shí)施例49、50或51中任一項(xiàng)的方法，其中所述投予通過(guò)注射進(jìn)行。
[0178] 53.實(shí)施例52的方法，其中所述注射為單次注射。
[0179] 54.-種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其包括：（i)以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的1.2重量％存在的基于 毒素的治療性蛋白質(zhì)；（ii )?1^^、？1^2六、？1^3六、？1^5￡或?1^7￡聚合物；以及（^1)以所述儲(chǔ) 槽式調(diào)配物的0.1重量％存在的PVA表面活性劑，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有 效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述基于毒素的治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。
[0180] 55.-種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其包括:包括基于毒素的治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)部水相，所述 基于毒素的治療性蛋白質(zhì)以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的1.2重量％存在，以及一或多種緩沖劑，包 括磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸或其組合，其中所述內(nèi)部水相的pH為5.0-8.5; (ii)基 于?1^14、24、34、5￡或7￡聚合物的固體/油相；以及（111)包括以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.01-0.10重量％存在的PVA表面活性劑的外部水相，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有 效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述基于毒素的治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。
[0181] 56.-種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，包括：（i)以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的1.2重量％存在的SEQ ID 勵(lì)：1到260的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)；（^汗1^14、24、34、5￡或7￡聚合物 ；以及（^1)以所 述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.01-0.1重量％存在的PVA表面活性劑，其中在單次投予后所述儲(chǔ)槽式 調(diào)配物在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述基于毒素的治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。
[0182] 57.-種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其包括：（i)內(nèi)部水相，其包括以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的1.2 重量％存在的SEQ ID N0:1-260的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)；一或多種緩沖劑，包括磷酸 鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸或其組合；以及一或多種鹽，包括NaCl、KCl、CaCl 2、MgCl2、 (NH4)2C〇3或其組合，其中所述內(nèi)部水相的pH為5.0-8.5;(ii)基于?1^^、24、3六、5￡或7￡聚合 物的固體/油相；以及（iii)外部水相，其包括以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.01-0.1重量％存在 的PVA表面活性劑，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后持續(xù)釋放所述基于毒素的治療性 蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。
[0183] 58. -種在受試者體內(nèi)獲得治療性肽的持續(xù)釋放的方法，其包含向所述受試者投 予實(shí)施例1到48或54到57中任一項(xiàng)所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，由此獲得所述治療性肽在所述受 試者體內(nèi)的持續(xù)釋放。
[0184] 59.實(shí)施例58的方法，其中所述持續(xù)釋放通過(guò)以下證明：（1)在單次投予后在有效 含量?jī)?nèi)釋放至少一個(gè)月；（2)在單次投予后在C max&〇F均比率不超過(guò)5或不超過(guò)3的有效含量 內(nèi)釋放至少一個(gè)月；（3)在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)釋放至少56天;和/或(4)在單次投予后 在Cmax比_比率不超過(guò)5或不超過(guò)3的有效含量?jī)?nèi)釋放至少56天。
[0185] 實(shí)例1.制備治療性蛋白質(zhì)的儲(chǔ)槽式調(diào)配物.聚合物、溶劑、水相、緩沖劑、賦形劑和 共溶劑的重量/體積和比例如下:將1.〇g聚合物溶解于5. OmL二氯甲烷中。接著添加0.5mL含 100mg/mL ShK-186(或ShK-192)的20mM磷酸鹽緩沖生理食鹽水（？83 4冊(cè).0)。使用10父 195mm探針在20，000rpm下將初級(jí)乳液均質(zhì)化2分鐘。接著將初級(jí)乳液添加到20mM磷酸鹽緩 沖液(pH 6.0)、0.5%二辛基磺基丁二酸酯(005)和0.05%?￥4的水溶液中；并且使用20\ 195mm探針在26, OOOrpm下均質(zhì)化2分鐘。向二次乳液中添加攪拌棒并且在通風(fēng)櫥中攪拌懸 浮液隔夜以使揮發(fā)性溶劑蒸發(fā)。第二天，通過(guò)325網(wǎng)篩過(guò)濾懸浮液。將過(guò)濾的材料離心（20， 〇〇〇g，5分鐘）并且抽出清液層，并且通過(guò)包括高效液相色譜(HPLC)和針對(duì)蛋白質(zhì)（ShK-186 或ShK-192)含量的二喹啉甲酸(BCA)的方法分析以測(cè)定封裝效率。
[0186] 選擇用于制備這一實(shí)例中評(píng)定的不同儲(chǔ)槽式調(diào)配物的聚合物包括低分子量(MW) PLG，例如PLG1A;中等MW PLG，例如PLG2A;以及高M(jìn)W PLG，例如PLG3A，其全部為親水性羧基 封端的(H系列）。測(cè)試的額外聚合物是PLG5E和PLG7E，它們都是酯化的(E系列）。這一實(shí)例中 所用的聚合物購(gòu)自湖岸生物材料(Lakeshore Biomaterials)。
[0187] 實(shí)例2.測(cè)量治療性蛋白質(zhì)從持續(xù)釋放的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的封裝、質(zhì)量平衡和體外釋 放.通常在緊接儲(chǔ)槽式調(diào)配物之后，通過(guò)在分離法(例如離心)之后并且使用等式（1)分析清 液層的游離蛋白質(zhì)含量來(lái)測(cè)量封裝百分比：
[0188] 封裝％ =(總ShK-清液層ShK)/總ShK
[0189] 典型封裝效率在60到90%范圍內(nèi)。
[0190] 通過(guò)加熱超過(guò)聚合物的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度對(duì)系統(tǒng)加壓以幾乎完全釋放ShK蛋白質(zhì)， 添加表面活性劑物質(zhì)（例如濃SDDS)，機(jī)械攪拌，超聲波處理，堿或酸水解，或這些加速釋放 方法的多種組合來(lái)實(shí)現(xiàn)質(zhì)量平衡?？梢酝ㄟ^(guò)在多個(gè)時(shí)間和不同條件下取樣清液層并且應(yīng)用 等式(2)獲得典型體外釋放曲線：
[0191] 釋放％ =清液層ShK/總ShK
[0192] 為了測(cè)量體外釋放，將溶液置換成去離子水、2w/v%表面活性劑SDDS(水溶液）、1 XPBS和20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)。在軌道運(yùn)動(dòng)振動(dòng)臺(tái)上攪拌不同樣品并且保持于37°C的 溫度下。通過(guò)在不同時(shí)間（通常t = 0天到t=15天)抽取的清液層BCA或逆相(RP)-HPLC分析 測(cè)量蛋白質(zhì)隨時(shí)間的釋放。
[0193] 圖1示出了五種不同儲(chǔ)槽式調(diào)配物的ShK-186的體外釋放。調(diào)配物如實(shí)例1中所述 使用一定范圍的PLG制成，所述PLG具有不同分子量和封端化學(xué)性質(zhì)。結(jié)果顯示末端(封端） 基團(tuán)對(duì)調(diào)節(jié)長(zhǎng)期釋放的作用，這可能由于與治療性蛋白質(zhì)的相互作用。這類(lèi)測(cè)量的差示和 絕對(duì)特征可幫助形成體外/體內(nèi)相關(guān)性作為針對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量控制的調(diào)配物特性的功能測(cè)試。 在這一情形下，相較于從基于羧基封端的聚合物(PLG1A、2A和3A)觀測(cè)的釋放，體外可見(jiàn)治 療性蛋白質(zhì)從使用酯封端聚合物PLG5E和PLG7E制成的調(diào)配物的更快速初始釋放。
[0194] 實(shí)例3.儲(chǔ)槽式調(diào)配物物理特性的表征.采用標(biāo)準(zhǔn)分析型表征方法來(lái)分析本文所披 露的ShK-186的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的物理和化學(xué)特性并且根據(jù)實(shí)例1的方法使用PLG2A聚合物形 成。使用馬爾文納米分粒器(Malvern nanosizer)通過(guò)光散射測(cè)量尺寸和電泳迀移率。通過(guò) 光學(xué)顯微鏡測(cè)量形態(tài)/均勻性。結(jié)果顯示于圖2-4中。
[0195] 圖2A和2B顯示如通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射所測(cè)量的三個(gè)獨(dú)立批次的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的分散 液尺寸。圖2A和2B顯示通過(guò)如通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射所測(cè)量的調(diào)配物懸浮液的強(qiáng)度（圖2A)和按體 積計(jì)(圖2B)繪制的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的尺寸分布。
[0196] 圖3為儲(chǔ)槽式調(diào)配物的（電位(如通過(guò)電泳迀移率所測(cè)量的粒子表面電荷）的測(cè)量 值。陰離子表面層幫助賦予水性懸浮液中的分散穩(wěn)定性乂電位測(cè)量值顯示電荷為_(kāi)75、_72 和-72mV的陰離子粒子的類(lèi)似緊湊簇，提供通過(guò)靜電排斥有助于膠體穩(wěn)定性的庫(kù)侖相互作 用。
[0197] 圖4為顯示PLG調(diào)配物的形狀和大致均勻幾何尺寸的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的光學(xué)顯微鏡 圖像。所述圖顯示PLG調(diào)配物囊封ShK-186的光學(xué)顯微（100X)圖像，顯示具有一微米尺寸的 圓形(可能球形)粒子。
[0198] 總體而言，本實(shí)例證實(shí)這一實(shí)例中所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的平均尺寸為1微米（圖 4)，如電泳迀移率所測(cè)量球體的表面/界面邊界的凈電荷為-75mV-72mV(圖3)指示膠體穩(wěn) 定性，并且調(diào)配物顯示均勻球形幾何結(jié)構(gòu)（圖4)。
[0199] 實(shí)例4.體內(nèi)評(píng)估儲(chǔ)槽式調(diào)配物.遵照以下方法制備這一實(shí)例中所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配 物。在低速攪拌下，將1. 〇g PLG聚合物（1A、2A或3A)溶解于5. OmL二氯甲烷中，直到聚合物在 10mL燒杯中完全溶解。添加500yL ShK-186(在具有140mM NaCl的20mM磷酸鈉水性緩沖液 (pH 6.0)中，獲得20mg/mL蛋白質(zhì)的最終濃度)并且使用10 X 195mm探針在26，OOOrpm下均質(zhì) 化2分鐘。將全部w/o乳液倒入100mL PyrexS' (康寧公司（Corning, Inc.)，康寧（Corning)， 紐約（New York))1395培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)瓶中裝有20mL 0.5重量％DSS、20mM磷酸鹽(pH 7.0)和0.05重量％ PVA水溶液。
[0200] 使混合物在相同剪切設(shè)置（26，OOOrpm)下均質(zhì)化5分鐘，使燒杯與熔融冰(0°C )熱 接觸。產(chǎn)生劑探針保持完全浸沒(méi)在液體中以限制材料發(fā)泡和溢出。乳液由于膠體散射而變 成乳白色。檢驗(yàn)水(外部)相pH并且必要時(shí)調(diào)整到5〈pH〈7.5。從剪切去除調(diào)配物，在通風(fēng)櫥中 在室溫下攪拌隔夜以使溶劑蒸發(fā)(二氯甲烷）。輕輕覆蓋培養(yǎng)瓶以避免水過(guò)度蒸發(fā)隔夜。
[0201] 第二天，通過(guò)325網(wǎng)篩過(guò)濾懸浮液。通過(guò)網(wǎng)篩去除極少(〈5%)固體材料。接著在室 溫下儲(chǔ)存懸浮液，上下顛倒混合以避免沉降/結(jié)塊。通過(guò)離心懸浮液，抽取清液層相并且通 過(guò)例如BCA或HPLC的方法分析ShK-186含量，來(lái)測(cè)量封裝百分比。PLG1A、2A和3A的封裝效率 分別是88%、87 %和82 %。
[0202]即將注射使用之前，在2,000g下，在4°C下，利用適當(dāng)體積離心調(diào)配物8分鐘。固體 粒子沉降到底部，傾析幾乎澄清或略微混濁的清液層，隨后用適當(dāng)體積和組合物(緩沖劑、 pH和離子強(qiáng)度)置換水溶液，隨后機(jī)械混合以再懸浮粒子(必要時(shí)渦旋）獲得均勻且自由流 動(dòng)的分散液(乳白色）。
[0203]使用23號(hào)針用lmL指定儲(chǔ)槽式調(diào)配物對(duì)史泊格多利大鼠（雄性，年輕8-16周，每種 病狀n = 1)進(jìn)行SC注射。在注射后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取血液并且通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELI SA) 測(cè)定 ShK-186。
[0204]從遵照這一程序制備的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的體內(nèi)釋放特征的實(shí)例顯示于圖5A(線性濃 度)和圖5B(對(duì)數(shù)濃度）中。與在15分鐘內(nèi)達(dá)到Cmax，接著不斷降低并且在一天內(nèi)消除到極低 含量的治療性蛋白質(zhì)的生理食鹽水溶液相比，使用ShK-186和PLG聚合物1A和2A形成的儲(chǔ)槽 式調(diào)配物在4天產(chǎn)生可檢測(cè)蛋白質(zhì)，并且PLG2A的調(diào)配物直到第18天也可檢測(cè)?；赑LG3A的 調(diào)配物在體內(nèi)產(chǎn)生較低水平的藥物持續(xù)釋放。
[0205] 實(shí)例5.使用ShK-186和ShK-192與PLG2A的儲(chǔ)槽式調(diào)配物的體內(nèi)劑量反應(yīng).如下進(jìn) 行儲(chǔ)槽式調(diào)配物的制備:使用機(jī)械攪拌將1.〇g PLG2A溶解于5.OmL二氯甲烷中直到聚合物 完全溶解。單獨(dú)地向三種獨(dú)立PLG2A制劑中添加包括三種ShK-186含量的500yL體積(40、20 和10mg/mL最終濃度;在具有140mM NaCl的20mM磷酸鈉水性緩沖液(pH 6.0)中），并且用10 X 195mm探針(26,000rpm)均質(zhì)化2分鐘。接著將w/o乳液倒入100mL Pyrcx?.1395培養(yǎng)瓶中， 所述培養(yǎng)瓶裝有20mL 0.5重量％DSS和20mM磷酸鹽(pH 7.0)水溶液。使混合物在相同剪切 設(shè)置(26，OOOrpm)下均質(zhì)化5分鐘，使燒杯與熔融冰(0 °C)熱接觸。檢驗(yàn)水(外部)相的pH并且 必要時(shí)調(diào)整到5.0〈pH〈7.5。
[0206]接著從剪切去除調(diào)配物，并且在通風(fēng)櫥中在室溫下攪拌隔夜以使溶劑蒸發(fā)。第二 天早晨，通過(guò)325網(wǎng)篩過(guò)濾懸浮液并且在室溫下儲(chǔ)存，上下顛倒混合以避免沉降/結(jié)塊。即將 注射使用之前，在2,000g下，在4°C下，利用適當(dāng)體積離心調(diào)配物8分鐘。固體粒子沉降到底 部，允許傾析幾乎澄清的清液層，隨后用適當(dāng)體積和組合物(例如PBS)置換水溶液，隨后機(jī) 械混合以再懸浮粒子。
[0207]用lmL指定儲(chǔ)槽式調(diào)配物對(duì)史泊格多利大鼠（雌性，年齡8-16周，n = 3)進(jìn)行SC注 射。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取血液并且通過(guò)ELI SA方法分析ShK-186。
[0208] 圖6A和6B顯示與PLG2A-起調(diào)配的不同劑量（高=40，000yg/kg，中等=20，000yg/ kg，低= 10,000yg/kg)的ShK-186的體內(nèi)釋放（圖6A顯示線性濃度并且圖6B顯示對(duì)數(shù)濃度）。 ShK-186的血清含量在相對(duì)窄濃度范圍上保持超過(guò)30天。如圖6A和6B中所示，釋放特征的相 對(duì)形狀幾何學(xué)上類(lèi)似，但曲線下面積根據(jù)ShK-186的總劑量按比例調(diào)整。這些結(jié)果表明長(zhǎng)效 儲(chǔ)槽式調(diào)配物可以經(jīng)調(diào)配以保持生物有效和完整ShK-186在長(zhǎng)時(shí)間段的循環(huán)含量。
[0209] 進(jìn)行這一實(shí)例的下一部分以測(cè)試ShK-192的調(diào)配物和ShK-192在長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間內(nèi)的 體內(nèi)釋放類(lèi)似于用于ShK-186的方法，使用機(jī)械攪拌將1.0g PLG2A溶解于5.OmL二氯甲烷中 直到聚合物完全溶解。通過(guò)用l〇X195mm探針（26,000印111)均質(zhì)化2分鐘來(lái)調(diào)配5001^體積， 其包括低劑量的ShK-192(10mg/mL最終濃度;在具有140mM NaCl的20mM磷酸鈉水性緩沖液 (pH 6.0)中）。接著將w/o乳液轉(zhuǎn)移到100mL Pyrc>c?1395培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)瓶裝有20mL 〇. 5重量％ DSS、20mM磷酸鹽(pH 7.0)、水溶液。
[0210] 混合物保持與冰水(0 °C )熱接觸并且在26，OOOrpm下均質(zhì)化5分鐘，檢驗(yàn)水(外部） 相的最終pH并且調(diào)整到5.0〈pH〈7.5。接著從均質(zhì)化去除調(diào)配物并且在通風(fēng)櫥中在室溫下機(jī) 械攪拌隔夜以使溶劑蒸發(fā)。第二天，首先通過(guò)325網(wǎng)篩過(guò)濾懸浮液，接著在室溫下儲(chǔ)存，上下 顛倒混合以使沉降/結(jié)塊降到最低。即將體內(nèi)使用之前，在2,000g下，在4°C下，利用適當(dāng)體 積離心調(diào)配物8分鐘。固體粒子分離到底部，允許傾析幾乎澄清的清液層，隨后用適當(dāng)體積 和組合物的水性緩沖劑(例如PBS)置換水溶液，隨后機(jī)械混合以再懸浮粒子。接著抽取懸浮 液（lmL)并且使用23號(hào)針以SC注射向大鼠（n = 3)投予。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取血液并且使用 ELISA分析法分析ShK-192。
[0211]圖7A和7B為單次SC注射之后史泊格-多利大鼠體內(nèi)以10,000yg/kg給藥的ShK-192 的體內(nèi)釋放的曲線圖（圖7A示出了線性濃度并且圖7B示出了對(duì)數(shù)濃度）。幾乎t=12天時(shí)達(dá) 到最大濃度表明治療性蛋白質(zhì)從儲(chǔ)槽式調(diào)配物逐漸釋放，這是一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)地持續(xù)30天的 過(guò)程?？傮w來(lái)說(shuō)，圖7示出了史泊格-多利大鼠體內(nèi)ShK-192的血清含量的時(shí)程，標(biāo)準(zhǔn)差繪制 成y軸誤差范圍。這一曲線表明調(diào)配出不同生物分子活性Kvl.3通道抑制劑以獲得隨超過(guò)一 個(gè)的長(zhǎng)時(shí)間段的持續(xù)釋放和有效血清濃度。
[0212] 在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，監(jiān)測(cè)ShK-186的血液含量的時(shí)間延長(zhǎng)。如圖8中可以看出，史泊格-多利大鼠體內(nèi)20,000yg/kg下的單次SC劑量（lmL)的用PLG2A調(diào)配的ShK-186的體內(nèi)釋放持 續(xù)至少56天。
[0213] 實(shí)例6. ShK-186和ShK-192儲(chǔ)槽式調(diào)配物在包括延遲型過(guò)敏大鼠模型的自體免疫 疾病動(dòng)物模型中的療效.在第〇天使用20GX 11/2針在路易斯大鼠（Lewis rat)的尾巴基部， 通過(guò)SC投予用在完成弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)中1: l(v/v)混合的100 yg卵白蛋白（0VA/CFA，200yL體積)接種。在第7天，通過(guò)使用29G X 1針向異氟醚麻醉的動(dòng)物 的耳朵的耳廓注射20yg OVA(lOiiL)，在耳部引起遲發(fā)型過(guò)敏(DTH)。在第8天和第9天，通過(guò) 使用測(cè)微器(測(cè)徑規(guī))測(cè)量抗原注射位點(diǎn)的硬結(jié)來(lái)評(píng)估DTH。使用ShK-186或ShK-192的對(duì)照 處理包括在第0-7天(從初始免疫開(kāi)始每天）以100iig/kg、1 Oyg/kg、3yg/kg或lyg/kg SC注射 ShK-186 或 ShK-192。將對(duì)照處理與第0 天(免疫時(shí)間）在l，000yg/kg、5,000yg/kg、10,000yg/ kg、20，000yg/kg或40，000yg/kg下使用基于PLG聚合物(在一個(gè)實(shí)例中，PLG2A)持續(xù)調(diào)配物 單次注射的ShK-186或ShK-192的儲(chǔ)槽式調(diào)配物進(jìn)行比較。
[0214] ShK-186或ShK-192的儲(chǔ)槽式調(diào)配物預(yù)期在以單次注射給藥時(shí)顯示顯著治療效果， 其中兩者都將使硬結(jié)(發(fā)炎性反應(yīng))減小到與每日SC注射緩沖液P6N(注射用水中10mM磷酸 鈉，0.8w/v%NaCl，0.05w/v%聚山梨醇酯20，pH= 5)中的ShK-186或ShK-192產(chǎn)生的結(jié)果相 當(dāng)?shù)乃交蜻M(jìn)一步減小。
[0215] 實(shí)例7. ShK-186和ShK-192儲(chǔ)槽式調(diào)配物在包括慢性復(fù)發(fā)性/緩解自體免疫腦脊髓 炎大鼠模型的自體免疫疾病動(dòng)物模型中的療效.通過(guò)向暗刺鼠大鼠（哈蘭公司(Harlan) )SC 注射脊髓勻漿(生物再生公司(Bioreclamation，Inc.))和CFA誘發(fā)慢性復(fù)發(fā)性/緩解自體免 疫腦脊髓炎(CR-EAE)。動(dòng)物通常在CR-EAE發(fā)作30天后恢復(fù)。在通過(guò)免疫誘發(fā)CR-EAE之前和 之后，以每天、每?jī)商旎蛎咳煸诓煌瑫r(shí)間點(diǎn)SC注射不同量的ShK-186或ShK-192(l、3、5、10 和lOOyg/kg)處理大鼠。這些方案與在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)以及疾病發(fā)作后（即大鼠的臨床評(píng)分為1 或更大之后（治療模型））以 1，〇〇〇yg/kg、5，000yg/kg、10，000yg/kg、20，000yg/kg 或 40，000y g/kg劑量給予的儲(chǔ)槽式調(diào)配物(ShK-186或ShK-192與PLG2A)單次注射進(jìn)行比較。
[0216] 對(duì)每日儲(chǔ)槽式調(diào)配物處理大鼠中的CR-EAE嚴(yán)重程度進(jìn)行臨床評(píng)分來(lái)測(cè)量處理功 效。在SC注射脊髓勻漿/CFA乳液之后持續(xù)設(shè)定時(shí)間段每日兩次使用以下評(píng)分系統(tǒng)對(duì)疾病進(jìn) 行監(jiān)測(cè)和評(píng)分：（〇)無(wú)疾?。唬?.5)遠(yuǎn)端尾無(wú)力；（1)尾無(wú)力；（2)輕度下肢輕癱，共濟(jì)失調(diào)；（3) 中度下肢輕癱，大鼠有時(shí)泮倒；（3.5)-條后肢癱瘓，另一條運(yùn)動(dòng)；（4)全部后肢麻痹；（5)全 部后肢麻痹和失禁；以及(6)垂死，呼吸困難，不進(jìn)食或飲水/立即施行安樂(lè)死。在實(shí)驗(yàn)的特 定時(shí)間點(diǎn)處死大鼠子組以采集組織或收集全血樣品。
[0217] 當(dāng)在預(yù)防和治療模型中以單次注射給藥時(shí)，預(yù)期ShK-186或ShK-192的儲(chǔ)槽式調(diào)配 物顯示顯著治療作用，例如臨床評(píng)分降低。預(yù)期這些作用與ShK-186或ShK-192在緩沖劑P6N 中每日給藥時(shí)測(cè)試的不同藥物投予方案所觀測(cè)到的作用相當(dāng)或比它更好。
[0218]實(shí)例8.牛皮癬的治療.自體免疫疾病牛皮癬為效應(yīng)記憶T細(xì)胞已顯示牽涉于疾病 中并且表達(dá)ShK-186的目標(biāo)(鉀通道Kv 1.3)的自體免疫疾病。牛皮癬患者用本文所披露的儲(chǔ) 槽式調(diào)配物給藥一次，接著在給藥后的不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)估以監(jiān)測(cè)治療性蛋白質(zhì)（例如ShK-186、ShK-192)的治療作用。打算評(píng)估的劑量包括0.1、1、10、100、1000、10,000、20,000或30， OOOmcg/Kg。評(píng)估時(shí)間點(diǎn)包括給藥后1、2、3、4、6、8、12、16、24周。為了評(píng)估單次注射儲(chǔ)槽式調(diào) 配物之后的治療性蛋白質(zhì)暴露，在注射后的所要時(shí)間點(diǎn)從患者收集血液樣品并且通過(guò)現(xiàn)有 生物分析方法檢測(cè)循環(huán)藥物量。還監(jiān)測(cè)牛皮癬的臨床評(píng)分。預(yù)期治療性蛋白質(zhì)持續(xù)釋放并 且臨床評(píng)分提尚。
[0219] 如所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，本文所披露的各實(shí)施例可包含其具體陳述的元 件、步驟、成分或組分或主要由它們組成或由它們組成。因此，術(shù)語(yǔ)"包括"應(yīng)解釋為列舉： "包含、由……組成或主要由……組成"。過(guò)渡術(shù)語(yǔ)"包含"意思是包括(但不限于），并且允許 納入甚至呈主要量的未指定元件、步驟、成分或組分。過(guò)渡短語(yǔ)"由……組成"不包括任何未 指定的元件、步驟、成分或組分。過(guò)渡短語(yǔ)"基本上由……組成"將實(shí)施例的范圍限于指定元 件、步驟、成分或組分以及不顯著影響實(shí)施例的那些。因?yàn)楸疚亩x了"持續(xù)釋放"，所以材 料作用將防止具體實(shí)施例實(shí)現(xiàn)治療性蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放。
[0220] 除非另外指示，否則說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的所有數(shù)值將理解成在所有情 況下由術(shù)語(yǔ)"約"修飾。因此，除非指明為相反的，否則在說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求書(shū)中所闡述 的數(shù)值參數(shù)是可能取決于試圖通過(guò)本發(fā)明獲得的所需特性而變化的近似值。最低限度地， 并且不打算限制等效物原則對(duì)權(quán)利要求書(shū)范圍的應(yīng)用，每一個(gè)數(shù)值參數(shù)都應(yīng)至少根據(jù)所報(bào) 告的有效數(shù)字的數(shù)值并且通過(guò)應(yīng)用一般四舍五入技術(shù)來(lái)解釋。當(dāng)需要進(jìn)一步闡明時(shí)，在結(jié) 合所陳述數(shù)值或范圍使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)「約」具有由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員合理地歸屬至其的意 義，即表示比所陳述值或范圍略大或略小，在所陳述值的±20 %的范圍內(nèi)；所陳述值的± 19 %的范圍內(nèi)；所陳述值的±18%的范圍內(nèi)、所陳述值的±17 %的范圍內(nèi)；所陳述值的土 16 %的范圍內(nèi)；所陳述值的±15 %的范圍內(nèi)；所陳述值的±14%的范圍內(nèi)；所陳述值的土 13%的范圍內(nèi)；所陳述值的±12%的范圍內(nèi)；所陳述值的±11 %的范圍內(nèi)；所陳述值的土 10%的范圍內(nèi)；所陳述值的±9%的范圍內(nèi)；所陳述值的±8%的范圍內(nèi)；所陳述值的±7% 的范圍內(nèi)；所陳述值的±6%的范圍內(nèi)；所陳述值的±5%的范圍內(nèi)；所陳述值的±4%的范 圍內(nèi)；所陳述值的± 3%的范圍內(nèi)；所陳述值的± 2%的范圍內(nèi)或所陳述值的± 1 %的范圍 內(nèi)。
[0221] 盡管闡述本發(fā)明廣泛范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但具體實(shí)例中所闡述的數(shù) 值是盡可能精確報(bào)告的。然而，任何數(shù)值固有地包括某些由其分別的測(cè)試測(cè)量值中所發(fā)現(xiàn) 的標(biāo)準(zhǔn)差必然造成的誤差。
[0222]除非本文另外指示或明顯與上下文相矛盾，否則在描述本發(fā)明的情形下(尤其在 隨附權(quán)利要求書(shū)的情形下)所用的術(shù)語(yǔ)"一(a/an)"、"所述"和類(lèi)似指示物應(yīng)解釋為涵蓋單 數(shù)和復(fù)數(shù)兩者。本文中值的范圍的敘述僅打算充當(dāng)個(gè)別地提及處于所述范圍內(nèi)的每個(gè)單獨(dú) 值的簡(jiǎn)寫(xiě)方法。除非本文另外指示，否則每一個(gè)個(gè)別值并入到本說(shuō)明書(shū)中，如同其在本文中 個(gè)別地列舉一般。除非本文另外指示或另外明顯與內(nèi)容相矛盾，否則本文所描述的所有方 法都可以按任何適合順序進(jìn)行。本文中提供的任何和所有實(shí)例或示范性語(yǔ)言(例如"例如"） 的使用，僅打算更好地闡明本發(fā)明，并且不對(duì)以其它方式所要求的本發(fā)明范圍造成限制。本 說(shuō)明書(shū)中的任何語(yǔ)言都不應(yīng)被解釋為指示任何未要求的要素對(duì)于實(shí)踐本發(fā)明來(lái)說(shuō)是必需 的。
[0223] 本文所披露的本發(fā)明的替代性要素或?qū)嵤├姆纸M不應(yīng)解釋為限制。每一個(gè)群組 成員都可以個(gè)別地或以與所述群組中其它成員或本文中所見(jiàn)其它要素的任何組合形式來(lái) 提到和要求。預(yù)期群組中的一或多個(gè)成員可以出于便利性和/或?qū)＠缘脑蚨ㄓ谌?組中或從群組刪除。當(dāng)任何此類(lèi)納入或刪除發(fā)生時(shí)，本說(shuō)明書(shū)被認(rèn)為如所修改地包括群組， 因此滿(mǎn)足所附權(quán)利要求書(shū)中所用的所有馬庫(kù)西(Markush)群組的書(shū)面描述。
[0224] 本文中描述了本發(fā)明的某些實(shí)施例，包括本發(fā)明人已知的用于進(jìn)行本發(fā)明的最佳 模式。當(dāng)然，在閱讀前述描述之后，這些所描述實(shí)施例的變化對(duì)于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將變 得顯而易見(jiàn)。本發(fā)明人期望熟練技術(shù)人員適當(dāng)時(shí)采用這些變化，并且本發(fā)明人打算以不同 于本文中特定描述的其它方式來(lái)實(shí)施本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括可適用的法律所允許的、在 此所附的權(quán)利要求書(shū)中敘述的主題的所有變更和等效物。此外，除非本文中另有說(shuō)明或另 外明顯與內(nèi)容相矛盾，否則本發(fā)明涵蓋上述要素以其所有可能的變化形式的任何組合。
[0225] 此外，本說(shuō)明書(shū)全文已對(duì)公開(kāi)案、專(zhuān)利和/或?qū)＠暾?qǐng)案(統(tǒng)稱(chēng)為"參考文獻(xiàn)"）做出 許多參考。所列舉參考文獻(xiàn)中的每一個(gè)針對(duì)其具體列舉傳授內(nèi)容獨(dú)立地以引用的方式併入 本文中。
[0226] 本文中所示的細(xì)節(jié)是作為實(shí)例并且僅出于說(shuō)明性論述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的目 的，并且是為了提供被認(rèn)為本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施例的原理和概念方面的最有用且容易理解的 描述而呈現(xiàn)。在這一方面，沒(méi)有嘗試比基礎(chǔ)理解本發(fā)明所必需的程度更詳細(xì)地展示本發(fā)明 的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，本說(shuō)明書(shū)加上圖示和/或?qū)嵗沟盟鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員很清楚如何在實(shí)際中 實(shí)施本發(fā)明的幾種形式。
[0227] 除非實(shí)例中清晰且明確修改或當(dāng)意義的應(yīng)用顯現(xiàn)無(wú)意義或基本上無(wú)意義的任何 構(gòu)造時(shí)，否則用于本發(fā)明中的定義和解釋意思是并且打算控制任何未來(lái)構(gòu)造。在術(shù)語(yǔ)構(gòu)造 將使其無(wú)意義或基本上無(wú)意義的情況下，定義應(yīng)取自韋氏辭典(第3版)或所屬領(lǐng)域普通技 術(shù)人員已知的辭典(例如生物化學(xué)與分子生物學(xué)牛津辭典(安東尼史密斯(Anthony Smith) 編，牛津大學(xué)出版社，牛津，2004))。
[0228]最后，應(yīng)理解本文所披露的本發(fā)明實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的原理。可以采用的其它修 改處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，可以根據(jù)本文中的傳授內(nèi)容來(lái)利用例如(但不限于)本發(fā)明 的替代性配置。因此，本發(fā)明不限于如所精確展示和描述的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其由以下組成： (i) 由以下組成的粒子： (a) 內(nèi)部水相，其包含治療性蛋白質(zhì)SEQ ID N0:217或SEQ ID N0:218、緩沖劑和鹽，其 中所述粒子的所述內(nèi)部水相的pH為6.0-8.5;以及 (b) 包含聚(丙交酯-共-乙交酯）（PLG)2A的聚合物相；以及 (ii) 包圍所述粒子的水相，其包含聚（乙烯醇)PVA表面活性劑； 其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少 一個(gè)月。2. -種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其由以下組成： (i)由以下組成的粒子： (a) 內(nèi)部水相，其包含治療性蛋白質(zhì)SEQ ID NO:217或SEQ ID NO:218、緩沖劑和鹽，其 中所述粒子的所述內(nèi)部水相的pH為6.0-8.5;以及 (b) 聚合物相，其包含羧基封端的中等分子量PLG;以及 (i i)包圍所述粒子的水相，其包含表面活性劑； 其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少 一個(gè)月。3. -種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其由以下組成： (i)由以下組成的粒子： (a) 內(nèi)部水相，其包含具有至少一個(gè)二硫橋鍵、至少兩個(gè)二硫橋鍵或至少三個(gè)二硫橋鍵 的治療性蛋白質(zhì)、緩沖劑和鹽，其中所述粒子的所述內(nèi)部水相的pH為6.0-8.5，以及 (b) 包含PLG2A的聚合物相；以及 (i i)包圍所述粒子的水相，其包含PVA表面活性劑； 其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少 一個(gè)月。4. 一種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其由以下組成： (i)由以下組成的粒子： (a) 內(nèi)部水相，其包含具有至少一個(gè)二硫橋鍵、至少兩個(gè)二硫橋鍵或至少三個(gè)二硫橋鍵 的治療性蛋白質(zhì)、緩沖劑和鹽，其中所述粒子的所述內(nèi)部水相的pH為6.0-8.5，以及 (b) 聚合物相，其包含羧基封端的中等分子量PLG;以及 (i i)包圍所述粒子的水相，其包含表面活性劑； 其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少 一個(gè)月。5. -種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其基本上由以下組成： (i)內(nèi)部水相，其包含： (a) SEQ ID NO: 1-260中的任一者的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)，其以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物 的1.2%w/w存在， (b) 緩沖劑，其包含磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸或其組合，以及 (C)選自恥(：1、1((：1丄3(：12、]\%(：1 2、（順4)2〇)3或其組合的鹽， 其中所述內(nèi)部水相的pH為5.0-8.5; (ii)基于羧基封端的中等分子量PLG聚合物的固體/油相；以及 (i i i)外部水相，其包含以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.01-0.1 %w/w存在的PVA表面活性劑， 其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述基于毒素的治療性 蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。6. -種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其基本上由以下組成： (i) 內(nèi)部水相，其包含： (a) SEQ ID NO: 1-260中的任一者的基于毒素的治療性蛋白質(zhì)，其以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物 的1.2%w/w存在， (b) 緩沖劑，其包含磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸或其組合，以及 (C)選自恥(：1、1((：1丄3(：12、]\%(：1 2、（順4)2〇)3或其組合的鹽， 其中所述內(nèi)部水相的pH為5.0-8.5; (ii) 基于PLG2A聚合物的固體/油相；以及 (i i i)外部水相，其包含以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.01-0.1 %w/w存在的PVA表面活性劑， 其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述基于毒素的治療性 蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。7. -種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其基本上由以下組成：（i)SEQ ID NO: 1-260中的任一者的基于 毒素的治療性蛋白質(zhì)，其以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的1.2%w/w存在；（ii)PLG2A聚合物；以及 (i i i)以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的〇. 〇 1-0.1 % w/w存在的PVA表面活性劑;其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配 物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述基于毒素的治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。8. -種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其基本上由以下組成： (i) 內(nèi)部水相，其包含： (a) 基于毒素的治療性蛋白質(zhì)，其以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的1.2%w/w存在，以及 (b) 緩沖劑，其包含磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸或其組合， 其中所述內(nèi)部水相的pH為5.0-8.5; (ii) 基于PLG2A聚合物的固體/油相；以及 (i i i)外部水相，其包含以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.01 -0.10 % w/w存在的PVA表面活性 劑， 其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述基于毒素的治療性 蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。9. 一種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其基本上由以下組成：（i)基于毒素的治療性蛋白質(zhì)；（ii)PLG2A 聚合物；以及（iii)PVA表面活性劑，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持 續(xù)釋放所述基于毒素的治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。10. -種儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其基本上由以下組成：（i)內(nèi)部水相，其包含以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配 物的〇.〇25%w/w到5%w/w存在的治療性蛋白質(zhì)；（ii)基于聚合物的固體/油相；以及（iii) 外部水相，其包含以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的〇. 01 % w/w到1 % w/w存在的表面活性劑，其中所述 儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物選自聚（丙交酯）、聚（乙交 酯）、PLG、聚（乳酸）、聚（乙醇酸）、聚（乳酸-共-乙醇酸）、PLG-接枝聚乙二醇PEG或其摻合物 或共聚物。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物是丙交酯：乙交酯比率為1: 1 的 PLG〇13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)以所述儲(chǔ)槽式調(diào)配 物的0.025 % w/w;所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.25 % w/w;或所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物的2.5 % w/w存在。14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述表面活性劑選自聚山梨醇酯、PEG、 環(huán)氧乙燒-環(huán)氧丙烷ΡΕ0-ΡΡ0摻合物、泊洛沙姆(poloxamer)、磺基丁二酸二辛酯、PVA、聚乙 烯吡咯烷酮PVP或其組合。15. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有至少20個(gè)氨基 酸、至少21個(gè)氨基酸、至少22個(gè)氨基酸、至少23個(gè)氨基酸、至少24個(gè)氨基酸、至少25個(gè)氨基 酸、至少26個(gè)氨基酸、至少27個(gè)氨基酸、至少28個(gè)氨基酸、至少29個(gè)氨基酸、至少30個(gè)氨基 酸、至少31個(gè)氨基酸、至少32個(gè)氨基酸、至少33個(gè)氨基酸、至少34個(gè)氨基酸、至少35個(gè)氨基 酸、至少36個(gè)氨基酸、至少37個(gè)氨基酸、至少38個(gè)氨基酸、至少39個(gè)氨基酸、至少40個(gè)氨基 酸、至少41個(gè)氨基酸、至少42個(gè)氨基酸、至少43個(gè)氨基酸、至少44個(gè)氨基酸、至少45個(gè)氨基 酸、至少46個(gè)氨基酸、至少47個(gè)氨基酸、至少48個(gè)氨基酸、至少49個(gè)氨基酸、至少50個(gè)氨基 酸、至少51個(gè)氨基酸、至少52個(gè)氨基酸、至少53個(gè)氨基酸、至少54個(gè)氨基酸或至少55個(gè)氨基 酸。16. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有至少一個(gè)二硫 橋鍵、至少兩個(gè)二硫橋鍵、至少三個(gè)二硫橋鍵、至少四個(gè)二硫橋鍵或至少五個(gè)二硫橋鍵。17. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為基于毒素的治療 性蛋白質(zhì)。18. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為抑制電壓門(mén)控性 鉀通道的基于ShK的蛋白質(zhì)。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述抑制的電壓門(mén)控性鉀通道為 Κν? · 1、Kvl · 3、Kvl · 5、Kvl · 3/1 · 5、Κν1 · 6、Kv3 · 2或KCa3 · 1 通道。20. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 1-260中的任一者的序列。21. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為SEQ ID N0:208、 SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:257、SEQ ID N0:210、SEQ ID N0:219、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:221或其鹽。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為SEQ ID N0:217。23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為SEQ ID N0:218。24. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為SEQ ID N0:210。25. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次投予后在有 效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少40天、至少41天、至少42天、至少43天、至少44天、 至少45天、至少46天、至少47天、至少48天、至少49天、至少50天、至少51天、至少52天、至少 53天、至少54天、至少55天或至少56天。26. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物為PLG1A、PLG2A、PLG3A、 PLG5E或PLG7E。27. -種凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其基本上由以下組成：（i)基于聚合物的固體/油相，其包 含以所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物計(jì)〇.〇25%w/w到5%w/w分散于其中的治療性蛋白質(zhì)；（ii)以所 述凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物計(jì)0.01 %w/w到0.5%w/w表面活性劑；以及（iii)以所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào) 配物計(jì)0.5 % w/w到90 %w/w糖，其中在所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物復(fù)原后，所述復(fù)原的儲(chǔ)槽式調(diào) 配物在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少一個(gè)月。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述糖為蔗糖、甘露糖醇、海藻糖、 右旋糖或其組合。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述糖為蔗糖。30. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物選自聚（丙交酯）、聚 (乙交酯）、PLG、聚（乳酸）、聚（乙醇酸）、聚（乳酸-共-乙醇酸）、PLG-接枝PEG或其摻合物或共 聚物。31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物是丙交酯：乙交酯比率 為1:1的PLG。32. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)以所述凍干儲(chǔ) 槽式調(diào)配物的〇.〇25%w/w;以所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物的0.25%w/w;或以所述凍干儲(chǔ)槽式調(diào) 配物的2.5 % w/w存在。33. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述表面活性劑選自聚山梨醇酯、 PEG、環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷摻合物、泊洛沙姆、磺基丁二酸二辛酯、PVA、PVP或其組合。34. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有至少20個(gè) 氨基酸、至少21個(gè)氨基酸、至少22個(gè)氨基酸、至少23個(gè)氨基酸、至少24個(gè)氨基酸、至少25個(gè)氨 基酸、至少26個(gè)氨基酸、至少27個(gè)氨基酸、至少28個(gè)氨基酸、至少29個(gè)氨基酸、至少30個(gè)氨基 酸、至少31個(gè)氨基酸、至少32個(gè)氨基酸、至少33個(gè)氨基酸、至少34個(gè)氨基酸、至少35個(gè)氨基 酸、至少36個(gè)氨基酸、至少37個(gè)氨基酸、至少38個(gè)氨基酸、至少39個(gè)氨基酸、至少40個(gè)氨基 酸、至少41個(gè)氨基酸、至少42個(gè)氨基酸、至少43個(gè)氨基酸、至少44個(gè)氨基酸、至少45個(gè)氨基 酸、至少46個(gè)氨基酸、至少47個(gè)氨基酸、至少48個(gè)氨基酸、至少49個(gè)氨基酸、至少50個(gè)氨基 酸、至少51個(gè)氨基酸、至少52個(gè)氨基酸、至少53個(gè)氨基酸、至少54個(gè)氨基酸或至少55個(gè)氨基 酸。35. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有至少一個(gè) 二硫橋鍵、至少兩個(gè)二硫橋鍵、至少三個(gè)二硫橋鍵、至少四個(gè)二硫橋鍵或至少五個(gè)二硫橋 鍵。36. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為基于毒素的 治療性蛋白質(zhì)。37. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為抑制電壓門(mén) 控性鉀通道的基于ShK的蛋白質(zhì)。38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述抑制的電壓門(mén)控性鉀通道為 Κν? · 1、Kvl · 3、Kvl · 5、Kvl · 3/1 · 5、Κν1 · 6、Kv3 · 2或KCa3 · 1 通道。39. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO: 1-260中的任一者的序列。40. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述治療性蛋白質(zhì)為SEQ ID NO: 208、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:257、SEQ ID N0:210、SEQ ID N0:219、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:221或其鹽。41. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述復(fù)原的儲(chǔ)槽式調(diào)配物在單次 投予后在有效含量?jī)?nèi)持續(xù)釋放所述治療性蛋白質(zhì)至少40天、至少41天、至少42天、至少43 天、至少44天、至少45天、至少46天、至少47天、至少48天、至少49天、至少50天、至少51天、至 少52天、至少53天、至少54天、至少55天或至少56天。42. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的凍干儲(chǔ)槽式調(diào)配物，其中所述聚合物為PLG1A、PLG2A、 PLG3A、PLG5E或PLG7E。43. -種在受試者體內(nèi)獲得治療性蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放的方法，其包含向所述受試者投 予根據(jù)權(quán)利要求1到42中任一權(quán)利要求所述的儲(chǔ)槽式調(diào)配物，由此獲得所述治療性蛋白質(zhì) 在所述受試者體內(nèi)的持續(xù)釋放。44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述持續(xù)釋放通過(guò)以下證明：（1)在單次投予后 在有效含量?jī)?nèi)釋放至少一個(gè)月；（2)在單次投予后在C madi〇F均比率不超過(guò)5或不超過(guò)3的有 效含量?jī)?nèi)釋放至少一個(gè)月；（3)在單次投予后在有效含量?jī)?nèi)釋放至少56天;和/或(4)在單次 投予后在Cmax對(duì)_比率不超過(guò)5或不超過(guò)3的有效含量?jī)?nèi)釋放至少56天。
【文檔編號(hào)】A61K9/16GK105873570SQ201480069029
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年12月23日
【發(fā)明人】S·P·艾度納托, E·J·穆諾茨, J·切斯科, E·J·塔查
【申請(qǐng)人】奇尼塔有限責(zé)任公司, 奇尼塔一有限責(zé)任公司