用于針對(duì)金黃色葡萄球菌的免疫的穩(wěn)定化的蛋白質(zhì)的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年8月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/695, 723的權(quán)益，其全部?jī)?nèi) 容通過引用納入本文以用于所有目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及包含衍生自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的抗原的免疫 原性組合物及其在免疫中的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性球菌，并且是血流、下呼吸道和皮膚以及其他 軟組織感染的主要原因。其導(dǎo)致從輕度皮膚感染到致命性疾病（包括肺炎和敗血癥）的多 種疾病，且在美國(guó)每年與金黃色葡萄球菌相關(guān)的死亡率超過了任意其他感染性疾?。ò?HIV/AIDS)〇
[0004] 目前沒有批準(zhǔn)的針對(duì)金黃色葡萄球菌的疫苗。在2005年的III期臨床試驗(yàn)中，與 安慰劑組相比，基于來自5型和8型細(xì)菌的表面多糖混合物的疫苗StaphVAX?無法減少感 染。參考文獻(xiàn)1報(bào)道了來自默克公司（Merck)和因特塞爾公司（Intercell)的"V710"疫苗 的數(shù)據(jù)，該疫苗基于單個(gè)抗原IsdB，這是一種保守的螯合鐵的細(xì)胞表面蛋白[2,3]。然而， V710的臨床試驗(yàn)在2011年終止，其依據(jù)是觀察到V710不可能表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的臨床 益處，且與安慰劑接受者相比，在疫苗接受者中出現(xiàn)了更高頻率的關(guān)于總體死亡率和多器 官功能障礙的安全問題[4]。
[0005] 參考文獻(xiàn)5公開了作為疫苗策略的多種金黃色葡萄球菌抗原及其組合。參考文獻(xiàn) 6公開了金黃色葡萄球菌多肽抗原在簡(jiǎn)單的緩沖溶液中不穩(wěn)定并可通過加入穩(wěn)定化添加劑 (如EDTA)穩(wěn)定抗原?？乖牟环€(wěn)定性是不希望的，因?yàn)椋?)這使得疫苗無法在給予前長(zhǎng)時(shí) 間儲(chǔ)存，以及（2)各批次間疫苗的不一致性會(huì)影響質(zhì)量和管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的要求。此外，含有 這些不穩(wěn)定抗原的疫苗的生產(chǎn)會(huì)變得復(fù)雜且涉及多個(gè)純化步驟。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo) 是鑒定用于在免疫原性組合物中穩(wěn)定金黃色葡萄球菌多肽抗原的其他策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，防止抗原的寡聚化是增強(qiáng)抗原穩(wěn)定性的有效策略。多種金黃色葡萄 球菌抗原含有半胱氨酸殘基，且它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中可形成寡聚體，包括由半胱氨酸殘 基之間的二硫鍵形成的共價(jià)二聚體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有這些共價(jià)二聚體的組合物可以是不 穩(wěn)定的，且可形成聚集體或影響組合物中其他抗原的穩(wěn)定性（如果存在）?？赏ㄟ^取代、修 飾或刪除半胱氨酸殘基從而使二硫鍵無法形成的方式防止共價(jià)二聚體的形成。有趣的是， 防止這些抗原形成共價(jià)二聚體提高了抗原穩(wěn)定性并維持了組合物的高總體選擇性（即相 對(duì)于總體抗原存在高比例的單個(gè)同種型）和純度。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這些半胱氨酸缺陷型 抗原在引發(fā)針對(duì)野生型含半胱氨酸抗原的免疫應(yīng)答中仍是有效的。因此，可在疫苗制劑中 包含半胱氨酸缺陷型抗原以提高抗原穩(wěn)定性。
[0007] 天然狀態(tài)下Sta006抗原在其成熟形式中具有N端半胱氨酸。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，刪除半 胱氨酸停止了二聚化并生成較易于表征和分析的蛋白，而不對(duì)免疫原性產(chǎn)生負(fù)面影響。含 有半胱氨酸缺陷型Sta006抗原的組合物較穩(wěn)定。因此，本發(fā)明提供了一種氨基酸序列與 SEQ ID N0:4具有至少90% (例如大于等于91%、大于等于92%、大于等于93%、大于等 于94%、大于等于95%、大于等于96%、大于等于97%、大于等于98%、大于等于99%、大 于等于99.5% )相同性的多肽，該多肽沒有游離的巰基且能夠引發(fā)（例如在給予人時(shí)）識(shí) 別野生型Sta006抗原（例如由氨基酸序列SEQ ID N0:2組成的金黃色葡萄球菌蛋白）的 抗體。該多肽不能通過二硫鍵形成共價(jià)二聚體。
[0008] 本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的多肽的免疫原性組合物。該組合物可以是水性形 式，此時(shí)理想情況下其pH為5至8。該組合物還可包括佐劑，例如鋁鹽。
[0009] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，該免疫原性組合物還包含其他抗原，該抗原可以是 多肽和/或糖。例如，其還可包括一種或多種金黃色葡萄球菌莢膜糖偶聯(lián)物，例如針對(duì)血清 型5和/或血清型8菌株。在其他實(shí)施方式中，該組合物不包含其他葡萄球菌多肽抗原。在 其他實(shí)施方式中，該組合物不包括其他葡萄球菌抗原。在另一個(gè)實(shí)施方式中，該組合物不包 含其他抗原。
[0010] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的免疫原性組合物的凍干物。該凍干物可使用水性材料重 建以提供水性的本發(fā)明的免疫原性組合物。為進(jìn)行給藥，對(duì)凍干物使用合適的液體稀釋劑 (例如緩沖液、鹽水溶液、用于注射的水（WFI))重建。該液體稀釋劑可包括佐劑，例如鋁鹽 或水包油乳液佐劑。
[0011] Sta006
[0012] "Sta006"抗原以有用的免疫原的形式公開于參考文獻(xiàn)5中。其最初標(biāo)注為 "鐵色素結(jié)合蛋白"，且在文獻(xiàn)[7]中也稱為"FhuD2"。在NCTC 8325菌株中，Sta006是 SA0UHSC_02554 且具有氨基酸序列 SEQ ID N0:1(GI:88196199)。在 Newman 菌株中，它是 nwmn_2185 (GI: 151222397)。Sta006的突變形式可參見參考文獻(xiàn)8。已知的Sta006抗原在 其可發(fā)生脂化的成熟形式中具有N端半胱氨酸。野生型含半胱氨酸的Sta006可以單體或 寡聚體（例如共價(jià)二聚體）的形式存在。
[0013] 本發(fā)明使用了無法通過二硫鍵形成共價(jià)二聚體的Sta006的變體形式。該多肽不 含有任何游離的巰基（在還原條件下）。其能夠引發(fā)識(shí)別野生型Sta006抗原（例如SEQ ID NO: 2)的抗體（例如在給予人時(shí)）。該多肽可包含與SEQ ID NO:4、5、6和7中任一條序 列具有 80%或更高（例如 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、 99. 5%或更高）相同性的氨基酸序列。
[0014] SEQ ID NO:4 是 SEQ ID NO: 1 的氨基酸殘基 19-302。與 SEQ ID NO:4 相比，SEQ ID N0:5在N端具有額外的氨基酸殘基"X"，其中"X"是不含有游離巰基的氨基酸。與SEQ ID N0:4 相比，SEQ ID N0:6 在 N 端具有 Met-Ala-Ser 序列。與 SEQ ID NO:5 相比，SEQ ID N0:7在N端具有Met-Ala-Ser序列。包含SEQ ID N0:4、5、6和7中任一條序列的Sta006 多肽可用于本發(fā)明。
[0015] 有用的Sta006變體形式可包含至少一個(gè)點(diǎn)突變，所述點(diǎn)突變?nèi)〈?、修飾或刪除了 野生型抗原形式中存在的半胱氨酸殘基。例如，Sta006多肽可含有SEQ ID N0:3的氨基酸 序列，其中可以取代、修飾或刪除SEQ ID N0:3第4位上的半胱氨酸殘基。優(yōu)選地，可使用 絲氨酸或丙氨酸殘基進(jìn)行取代?；蛘撸蓜h除半胱氨酸殘基（例如提供SEQ ID N0:6)。
[0016] 雜交多肽
[0017] 本發(fā)明所用的抗原可以單獨(dú)多肽的形式存在于組合物中。然而，使用一種以上抗 原時(shí)，它們不必須以單獨(dú)多肽的形式存在。相反，至少兩種（如2、3、4、5或更多種）抗原可 表達(dá)成一條多肽鏈（"雜交"多肽），如參考文獻(xiàn)5中所述。理想情況下，本發(fā)明所用的雜交 多肽不含有游離的巰基（在還原條件下）。
[0018] 由兩種、三種、四種或更多種抗原的氨基酸序列組成的雜交體是有用的。具體地， 優(yōu)選由兩種、三種、四種或五種抗原（如兩種抗原）的氨基酸序列組成的雜交體。
[0019] 不同的雜交多肽可以在單一制劑中混合在一起。如本文他處所述，雜交多肽也可 與偶聯(lián)物或非金黃色葡萄球菌抗原組合。
[0020] 有用的是，這些雜交多肽可引發(fā)抗體（例如給予人時(shí)），該抗體識(shí)別雜交體中存在 的各野生型葡萄球菌蛋白。
[0021] 在一些實(shí)施方式中，單個(gè)雜交多肽中的抗原通過接頭氨基酸序列連接在一起。接 頭氨基酸序列一般較短（如20個(gè)或更少的氨基酸，S卩20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、 10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè)）。示例包括促進(jìn)克隆的短肽序列或聚甘氨酸接頭。其它合適的 接頭氨基酸序列對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
[0022] 本發(fā)明所用多肽
[0023] 本發(fā)明使用不形成二硫鍵的金黃色葡萄球菌抗原的變體形式。含有游離巰基（例 如半胱氨酸氨基酸）的金黃色葡萄球菌抗原可形成寡聚體，包括標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中的共價(jià)同源 或異源二聚體。共價(jià)二聚體通常通過半胱氨酸殘基的巰基的氧化生成，所述氧化導(dǎo)致形成 二硫鍵（即形成胱氨酸）。為消除共價(jià)二聚體的形成，本發(fā)明的多肽不含有任何能夠發(fā)生 反應(yīng)以形成二硫鍵的游離巰基（在還原條件下）。游離巰基也稱作未保護(hù)的巰基或游離或 未保護(hù)的-SH，具有反應(yīng)活性硫原子。半胱