本發(fā)明涉及衍生自轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(tgfβ1；tgfb-1)的新的多肽，以及編碼這種多肽的多核苷酸和包含這種肽的組合物。本發(fā)明還涉及增加對(duì)tgfb-1的免疫應(yīng)答選擇性的方法。本發(fā)明還涉及所述多肽、多核苷酸和組合物的用途和使用方法。

背景技術(shù)：

1、tgfb是一種多功能細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。有三種同種型，其中亞型1(tgfb-1)在t細(xì)胞免疫中特別重要。在癌癥的情況下，tgfb-1解除各種免疫細(xì)胞，如細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)、腫瘤相關(guān)的中性粒細(xì)胞和自然殺傷(nk)細(xì)胞的戒備。它還有助于腫瘤血管化和轉(zhuǎn)移。因此，tgfb1為腫瘤微環(huán)境(tumor?microenvironment，tme)中的關(guān)鍵抑制分子，有助于下調(diào)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤機(jī)制并使癌細(xì)胞能夠逃避免疫。

2、最近的臨床結(jié)果(kjeldsen,j.w.et?al.,nat.med.27(12):2212-2223(2021))提供了基于“反調(diào)節(jié)性”t細(xì)胞活化的癌癥免疫療法的基本原理。反調(diào)節(jié)性t細(xì)胞識(shí)別通常由免疫抑制細(xì)胞表達(dá)的抗原，從而將促炎信號(hào)靶向腫瘤微環(huán)境(andersen,m.h.,semin.immunopathol(2022))?；诎邢騮gfb受體的小分子抑制劑和基于可溶性tgfb受體的捕獲配體的治療劑靶向tgfb的所有三種同種型(tgfb-1、tgfb-2和tgfb-3)，并且靶向額外的tgfb同種型(tgfb-2、tgfb-3)被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致不利的臨床效應(yīng)(tauriello,d.v.f.,e.sancho,and?e.batlle,nat.rev.cancer,22(1):25-44(2022))。

3、激活tgfb-1選擇性t細(xì)胞(與tgfb-2和tgfb-3無交叉反應(yīng)性)可使促炎免疫應(yīng)答靶向表達(dá)tgfb-1的腫瘤，同時(shí)避免與泛tgfb抑制相關(guān)的毒性。在人類中經(jīng)常檢測(cè)到tgfb-1選擇性t細(xì)胞(holmstrom,m.o.,et?al.,cell?mol.immunol.18(2):415-426(2021))。因此，目前需要增強(qiáng)抗tgfb-1免疫應(yīng)答的選擇性，以減輕潛在的脫靶毒性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明人先前已經(jīng)鑒定了具有免疫原性的tgfb-1的多肽片段。這些多肽片段在wo2020/245264中公開，其通過引用并入本文。本發(fā)明人現(xiàn)已從tgfb-1中鑒定出新的免疫原性多肽片段。

2、令人驚訝的是，本文公開的多肽刺激對(duì)tgfb-1具有選擇性的免疫應(yīng)答。換言之，本文公開的多肽刺激對(duì)tgfb-2和tgfb-3表現(xiàn)出低交叉反應(yīng)性的tgfb-1選擇性t細(xì)胞。因此，預(yù)期本發(fā)明的多肽在刺激針對(duì)表達(dá)tgfb-1的細(xì)胞的有益的選擇性免疫應(yīng)答方面特別有效。特別地，預(yù)期本發(fā)明的多肽增強(qiáng)針對(duì)表達(dá)tgfb-1的細(xì)胞的免疫應(yīng)答的選擇性，而不提高針對(duì)表達(dá)tgfb-2的細(xì)胞或表達(dá)tgfb-3的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。因此，預(yù)期本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出低的脫靶毒性。本發(fā)明的較長(zhǎng)多肽，如seq?id?no:7和10中所列的那些，也預(yù)期具有特別的免疫原性，因?yàn)樗鼈兛赡鼙容^短的tgfb-1多肽片段含有更多的表位。還預(yù)期這種肽在易于制造和配制方面具有改進(jìn)的性質(zhì)。

3、tgfb-1是一種二聚細(xì)胞因子，其具有通過分子內(nèi)二硫鍵連接在一起的半胱氨酸結(jié)構(gòu)。tgfb-1合成為單體390氨基酸前體蛋白，可被互換地稱為：tgfb-1前蛋白；tgfb-1前體；全長(zhǎng)tgfb-1；前-原-tgfb-1(pre-pro-tgfb-1)。tgfb-1前蛋白的全長(zhǎng)序列作為seq?id?no:1提供。

4、tgfb1前蛋白單體具有約25kda的分子量。tgfb-1蛋白單體具有三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域：信號(hào)肽(sp：氨基酸1-29；seq?id?no:4)、潛伏期相關(guān)肽(lap：氨基酸30-278；seq?id?no:5)和成熟肽(成熟tgfb-1：氨基酸279-390；seq?id?no:6)。

5、tgfb-1?sp將蛋白質(zhì)靶向分泌途徑；sp在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被裂解。包含lap和成熟tgfb-1的tgfb-1單體可以通過lap中的半胱氨酸殘基(例如cys?223和cys?225)和成熟tgfb-1肽(例如cys?356)之間的二硫鍵在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中二聚化，以形成tgfb-1同源二聚體。這種tgfb-1同源二聚體被稱為小潛在復(fù)合物(small?latent?complex，slc)。slc可能被所謂的潛在tgf-β-結(jié)合蛋白(ltbp)結(jié)合，以形成更大的復(fù)合物，其稱為大潛在復(fù)合物(largelatent?complex，llc)。llc可以分泌到細(xì)胞外介質(zhì)(ecm)中。然而，lap和ltbp的存在阻止了tgfb-1結(jié)合并激活其細(xì)胞外受體。活性tgfb-1由成熟tgfb-1肽的同源二聚體組成。成熟的tgfb-1同源二聚體從lap和ltbp中釋放出來有多種機(jī)制，包括蛋白酶降解lap、通過與血小板反應(yīng)蛋白相互作用誘導(dǎo)lap中的構(gòu)象變化以及l(fā)ap和tgfb-1之間的非共價(jià)鍵的斷裂。

6、本發(fā)明的一個(gè)目的是開發(fā)一種免疫原性多肽，其產(chǎn)生針對(duì)tgfb-1的選擇性免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一個(gè)目的是選擇性靶向tme中的免疫抑制細(xì)胞。考慮到tme中的免疫抑制細(xì)胞高度表達(dá)tgfb-1，因此選擇性靶向這些細(xì)胞上的tgfb-1可以消耗tme中的免疫抑制細(xì)胞。

7、因此，本發(fā)明提供了一種多肽，其為tgfb-1的免疫原性片段，并且其包含seq?idno:5的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸的序列或由seq?id?no:5的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸的序列組成。優(yōu)選地，所述多肽不包含半胱氨酸殘基。所述多肽可以與tgfb-2和/或tgfb-3的相應(yīng)的多肽序列具有較低的同源性。所述多肽可以與tgfb-2和/或tgfb-3的相應(yīng)的多肽序列具有較低的序列同一性。tgfb-2可以具有seq?id?no:2的氨基酸序列。tgfb-3可以具有seq?id?no:3的氨基酸序列。所述多肽片段可以與tgfb-2和/或tgfb-3的相應(yīng)多肽序列具有小于約80％、70％、60％、50％、40％、30％、25％或20％的序列同一性。優(yōu)選地，所述多肽與tgfb-2和/或tgfb-3的相應(yīng)的多肽序列具有小于約40％的序列同一性。所述多肽可以包含以下或由以下組成：seq?id?no:5的多達(dá)8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40個(gè)連續(xù)氨基酸。所述多肽可以包含以下或由以下組成：seq?id?no:5的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40個(gè)連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，所述多肽可以包含seq?id?no:5的至少25、26、27、28、29或30個(gè)連續(xù)氨基酸或由seq?id?no:5的至少25、26、27、28、29或30個(gè)連續(xù)氨基酸組成。更優(yōu)選地，所述多肽可以包含seq?id?no:5的至少30個(gè)連續(xù)氨基酸或由seq?id?no:5的至少30個(gè)連續(xù)氨基酸組成。所述多肽可以包含seq?id?no:32的氨基酸序列。所述多肽可以包含seq?id?no:7、10或11中任一個(gè)的氨基酸序列。所述多肽可以包含以下或由以下組成：seq?id?no:7、10、32、11、14或15中任一個(gè)的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述多肽包含seq?id?no:7的氨基酸序列或由seq?id?no:7的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，所述多肽包含seq?id?no:10的氨基酸序列或由seq?id?no:10的氨基酸序列組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽不包含seq?id?no:11、14和/或15的氨基酸序列或不由seq?id?no:11、14和/或15的氨基酸序列組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽不由seq?id?no:11、14和/或15的氨基酸序列組成。

8、所述多肽能夠刺激tgfb-1選擇性t細(xì)胞。所述tgfb-1選擇性t細(xì)胞可以對(duì)表達(dá)和/或呈遞tgfb-2和/或tgfb-3的多肽的細(xì)胞具有低交叉反應(yīng)性。表達(dá)和/或呈遞tgfb-2和/或tgfb-3的多肽的細(xì)胞可以是腫瘤微環(huán)境(tme)中的細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞。優(yōu)選地，這些細(xì)胞是免疫抑制細(xì)胞。所述細(xì)胞可以包括癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(caf)、cd8+t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、調(diào)節(jié)性cd4+t細(xì)胞、耗竭性cd8+t細(xì)胞、m1腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(m1_tam)、m2腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(m2_tam)、髓樣抗原呈遞細(xì)胞(apcmye)和/或其它細(xì)胞。

9、交叉反應(yīng)性的測(cè)量可以包括將所述tgfb-1選擇性t細(xì)胞對(duì)表達(dá)和/或呈遞tgfb-1的多肽的細(xì)胞的反應(yīng)性與所述tgfb-1選擇性t細(xì)胞對(duì)表達(dá)和/或呈遞來自tgfb-2或tgfb-3的相應(yīng)多肽的細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行比較。tgfb-1選擇性t細(xì)胞對(duì)表達(dá)和/或呈遞來自tgfb-2或tgfb-3的相應(yīng)多肽的細(xì)胞的反應(yīng)性可以小于所述tgfb-1選擇性t細(xì)胞對(duì)tgfb-1的多肽的反應(yīng)性的約50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％或0.1％。交叉反應(yīng)性可以通過ifnγelispot測(cè)定法測(cè)定。

10、本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。多核苷酸可以是分離的。多核苷酸可以包含在載體中。多核苷酸可以是信使rna(mrna)。mrna可以包含：

11、(a)編碼至少一種本發(fā)明的多肽的開放閱讀框(open?reading?frame，orf)；

12、(b)在5’端的5’端帽；

13、(c)包含在orf的5’的5’非翻譯區(qū)(utr)；

14、(d)包含在orf的3’的3’utr；和

15、(e)在3’端的3’加尾序列。

16、本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的多肽和/或本發(fā)明的多核苷酸以及任選的佐劑的組合物。所述組合物可以進(jìn)一步包含：至少一種不同的本發(fā)明的多肽；至少一種不同的本發(fā)明的多核苷酸；和/或至少一種藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或防腐劑。所述佐劑可以選自由基于細(xì)菌dna的佐劑、基于油/表面活性劑的佐劑、基于病毒dsrna的佐劑、咪唑喹啉和montanide?isa佐劑組成的組。優(yōu)選地，所述組合物可以是tgfb-1選擇性疫苗組合物。當(dāng)所述組合物包含多核苷酸并且所述多核苷酸是mrna時(shí)，所述組合物可以被配制在脂質(zhì)納米顆粒組合物中。脂質(zhì)納米顆粒組合物可以具有50-200nm的平均直徑。

17、本發(fā)明還提供了治療或預(yù)防受試者的疾病或病癥的方法，所述方法包括向受試者施用本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸和/或本發(fā)明的組合物。所述方法可以進(jìn)一步包括：同時(shí)或順序施用額外的癌癥療法，優(yōu)選抗體。當(dāng)疾病或病癥是癌癥時(shí)，所述方法還可以包括刺激對(duì)表達(dá)tgfb-1的癌細(xì)胞的選擇性免疫應(yīng)答。

18、本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防疾病或病癥的本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的組合物或其組合。多肽、多核苷酸、組合物或其組合可以與額外的癌癥療法(優(yōu)選抗體)聯(lián)合使用。當(dāng)疾病或病癥為癌癥時(shí)，多肽、多核苷酸、組合物或其組合可以刺激對(duì)表達(dá)tgfb-1的癌細(xì)胞的選擇性免疫應(yīng)答。

19、本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的組合物或其組合在制備用于治療或預(yù)防疾病或病癥的藥物中的用途。當(dāng)所述疾病或病癥為癌癥時(shí)，所述多肽、多核苷酸、組合物或其組合的用途可以用于制備用于刺激對(duì)表達(dá)tgfb-1的癌細(xì)胞的選擇性免疫應(yīng)答的藥物。

20、所述疾病或病癥可以至少部分由表達(dá)tgfb1的細(xì)胞的不適當(dāng)或過度的免疫抑制功能來表征。優(yōu)選地，所述疾病或病癥是癌癥。所述癌癥可以是食道癌或尿路上皮癌。所述癌癥可以是結(jié)腸直腸癌、胃癌、頭頸癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌(nsclc)或卵巢癌。所述癌癥可以是乳腺癌、宮頸癌、肝癌或胰腺癌。

21、所述疾病或病癥可以是腫瘤，并且所述多肽、多核苷酸、組合物或其組合能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境(tme)。本發(fā)明的方法和用途可以包括調(diào)節(jié)tme。調(diào)節(jié)可以包括增強(qiáng)t細(xì)胞對(duì)tme的浸潤(rùn)。優(yōu)選地，t細(xì)胞是cd4+t細(xì)胞。施用多肽、多核苷酸、組合物或其組合可以刺激對(duì)tme中表達(dá)tgfb-1的細(xì)胞的選擇性免疫應(yīng)答。

22、本發(fā)明還提供了刺激tgfb-1選擇性t細(xì)胞的方法，所述方法包括：將t細(xì)胞與本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的組合物或其組合接觸。

23、本發(fā)明還提供了刺激tgfb-1選擇性t細(xì)胞的離體方法，所述方法包括：將t細(xì)胞與本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的組合物或其組合接觸。

24、本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的組合物或其組合用于刺激tgfb-1選擇性t細(xì)胞的用途。所述用途可以包括：將t細(xì)胞與本發(fā)明的多肽、本發(fā)明的多核苷酸、本發(fā)明的組合物或其組合接觸。所述用途可以是非治療性的和/或離體的。

25、由本發(fā)明的肽、多核苷酸和/或組合物刺激的tgfb-1選擇性t細(xì)胞可以對(duì)表達(dá)和/或呈遞tgfb-2和/或tgfb-3的多肽的細(xì)胞具有低交叉反應(yīng)性。交叉反應(yīng)性的測(cè)量可以包括將所述tgfb-1選擇性t細(xì)胞對(duì)表達(dá)和/或呈遞tgfb-1的多肽的細(xì)胞的反應(yīng)性與所述tgfb-1選擇性t細(xì)胞對(duì)表達(dá)和/或呈遞來自tgfb-2或tgfb-3的相應(yīng)多肽的細(xì)胞的反應(yīng)性進(jìn)行比較。tgfb-1選擇性t細(xì)胞對(duì)表達(dá)和/或呈遞來自tgfb-2或tgfb-3的相應(yīng)多肽的細(xì)胞的反應(yīng)性可以小于所述tgfb-1選擇性t細(xì)胞對(duì)tgfb-1的多肽的反應(yīng)性的約50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％或0.1％。交叉反應(yīng)性可以通過ifnγelispot測(cè)定法測(cè)定。