本申請要求2014年5月8日提交的美國臨時申請第61/990,521號和2014年9月17日提交的美國臨時申請第62/051,724號的權(quán)益，所述臨時申請的公開內(nèi)容在此通過引用整體并入。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開在亨廷頓病的診斷學(xué)和治療學(xué)的領(lǐng)域中。

背景

亨廷頓病(HD)，也稱為亨廷頓舞蹈癥，是運動、認知和精神障礙的進行性障礙。該疾病的發(fā)病平均年齡是35-44歲，盡管在約10％的病例中，發(fā)病發(fā)生在21歲之前，并且該疾病的平均診斷后壽命為15-18年。患病率為100,000個具有西歐血統(tǒng)的人中約3至7人。

亨廷頓病是三核苷酸重復(fù)擴增病癥的實例，其最早在1990年代初被表征(見Di Prospero和Fischbeck(2005)Nature Reviews Genetics6:756-765)。這些病癥涉及成組的三核苷酸的不穩(wěn)定重復(fù)的局部擴增，并可導(dǎo)致擴增的重復(fù)駐留其中的基因的功能的喪失、有毒功能的獲得，或兩者。三核苷酸重復(fù)序列可位于該基因的任何部分，包括非編碼和編碼基因區(qū)域。位于編碼區(qū)之內(nèi)的重復(fù)通常包括重復(fù)的谷氨酰胺編碼三聯(lián)體(CAG)或丙氨酸編碼三聯(lián)體(CGA)。非編碼序列內(nèi)的擴增重復(fù)區(qū)可導(dǎo)致基因的異常表達，而編碼區(qū)內(nèi)的擴增重復(fù)(也稱為密碼子重復(fù)病癥)可引起錯誤折疊和蛋白質(zhì)聚集。與異常蛋白質(zhì)相關(guān)的病理生理學(xué)的確切原因通常是未知的。通常地，在經(jīng)歷三核苷酸擴增的野生型基因中，這些區(qū)域在正常群體中含有可變數(shù)目的重復(fù)序列，但在受影響的群體中，重復(fù)的數(shù)目可以從重復(fù)的數(shù)目的加倍增至對數(shù)級增加。在HD中，重復(fù)被插入在大胞質(zhì)蛋白亨廷頓蛋白(Huntingtin)(Htt)的N末端編碼區(qū)中。正常Htt等位基因包含15-20個CAG重復(fù)，而含有35個或更多個重復(fù)的等位基因可被認為是潛在地引起HD的等位基因并且賦予發(fā)生疾病的風(fēng)險。含有36-39個重復(fù)的等位基因被認為是不完全滲透的，并且那些攜帶那些等位基因的個體可發(fā)生或可以不發(fā)生疾病(或可在生命的后期發(fā)生癥狀)，而含有40個或更多個重復(fù)的等位基因被認為是完全滲透的。事實上，未曾報道過含有這么多重復(fù)的HD等位基因的無癥狀的人。那些年幼發(fā)作HD(<21歲)的個體經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)具有60個或更多個CAG重復(fù)。除了CAG重復(fù)的增加以外，還已經(jīng)顯示HD可涉及重復(fù)序列內(nèi)的+1和+2移碼，這使得該區(qū)域?qū)⒕幋a多絲氨酸多肽(在a+1移碼的情況下由AGC重復(fù)編碼的)束而不是聚谷氨酰胺(Davies和Rubinsztein(2006)Journal of Medical Genetics 43:893-896)。

在HD中，突變型Htt等位基因通常作為顯性性狀從一個親本遺傳而來。任何HD患者出生的兒童，如果另一個親本未患該病癥，則有50％的機會發(fā)生該疾病。在一些情況下，親本可具有中間HD等位基因并且是無癥狀的，而由于重復(fù)擴增，兒童表現(xiàn)出疾病。另外，HD等位基因還可顯示稱為預(yù)期的現(xiàn)象，其中由于在精子發(fā)生過程中重復(fù)區(qū)的不穩(wěn)定性質(zhì)，在幾代中觀察到發(fā)病的嚴重程度增加或發(fā)病年齡減小。

此外，Htt中的三核苷酸擴增導(dǎo)致紋狀體中的中間棘γ-氨基丁酸(GABA)投射神經(jīng)元中的神經(jīng)元損失，其中神經(jīng)元損失也發(fā)生在新皮質(zhì)中。含有腦啡肽并且突出至外部蒼白球的中間棘神經(jīng)元比包含物質(zhì)P的神經(jīng)元更多地參與并投射至內(nèi)部蒼白球。在亨廷頓病患者中受影響的其它腦區(qū)包括黑質(zhì)、皮質(zhì)層3、5和6、海馬的CA1區(qū)、頂葉角回區(qū)、小腦的浦肯野細胞、下丘腦的側(cè)結(jié)節(jié)核和丘腦的中腦旁核復(fù)合體(Walker(2007)Lancet 369:218-228)。

正常Htt蛋白的作用了解甚少，但其可參與神經(jīng)發(fā)生、凋亡細胞死亡和囊泡運輸。另外，有證據(jù)表明野生型Htt刺激腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)(紋狀體神經(jīng)元的促生存因子)的產(chǎn)生。已顯示HD的進展與HD小鼠模型中BDNF表達的降低相關(guān)(Zuccato等(2005)Pharmacological Research 52(2):133-139)，并且BDNF或膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)經(jīng)由腺相關(guān)病毒(AAV)載體介導(dǎo)的基因遞送的遞送可在HD小鼠模型中保護紋狀體神經(jīng)元(Kells等，(2004)Molecular Therapy 9(5):682-688)。

HD的診斷和治療選擇目前非常有限。在診斷方面，改變的(突變的)Htt(mHTT)水平與疾病負擔(dān)評分顯著相關(guān)，并且可溶性mHTT種類的濃度隨著疾病進展而增加。然而，低豐度的mHTT難以在患者CNS中定量，這限制了在體內(nèi)HD的神經(jīng)病理生物學(xué)中的作用的研究，并且排除了通過降HTT藥物進行的靶接合的證明。見，例如，Wild等(2014)J Neurol Neurosurg Psychiatry 85:e4。

關(guān)于治療，設(shè)計用于防止與通過延長的聚谷氨酰胺段發(fā)生的蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的毒性的一些潛在方法學(xué)，諸如伴侶蛋白的過表達或用化合物格爾德霉素誘導(dǎo)熱休克反應(yīng)已顯示出這些毒性在體外模型中的減小。其它治療靶向細胞凋亡在疾病的臨床表現(xiàn)中的作用。例如，疾病癥狀的減緩已經(jīng)由在一對小鼠的后代中的動物模型中半胱天冬酶活性的阻斷顯示，其中一個親本包含HD等位基因，另一個親本具有半胱天冬酶1的顯性負等位基因。另外，半胱天冬酶對突變型HD Htt的裂解可在疾病的致病性中起作用。已發(fā)現(xiàn)攜帶半胱天冬酶-6抗性突變型Htt的轉(zhuǎn)基因小鼠，相較于攜帶非半胱天冬酶抗性突變型Htt等位基因的小鼠，維持正常的神經(jīng)元功能并且不發(fā)生紋狀體神經(jīng)變性(見Graham等(2006)Cell 125:1179-1191)。靶向細胞凋亡途徑成員的分子也已顯示對癥狀學(xué)具有減慢的作用。例如，已顯示化合物zVAD-fmk和米諾環(huán)素(它們均抑制半胱天冬酶活性)減緩小鼠中的疾病表現(xiàn)。藥物瑞馬西胺也已被用于小型HD人試驗，因為該化合物被認為防止突變型Htt對NDMA受體的結(jié)合，以防止對神經(jīng)細胞的毒性作用的產(chǎn)生。然而，在這些試驗中沒有觀察到神經(jīng)元功能的統(tǒng)計學(xué)上顯著的改善。另外，亨廷頓研究小組使用輔酶Q進行了隨機雙盲研究。盡管觀察到利用輔酶Q10治療的患者中疾病進展較慢的趨勢，但總的功能性能力的下降速率沒有顯著變化。(Di Prospero和Fischbeck，同上)。

包含來自鋅指蛋白(“ZFP”)、TAL-效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(“TALE”)和CRISPR/Cas轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的基因表達的能力(參見，例如，美國專利第8,586,526號；第6,534,261號；第6,599,692號；第6,503,717號；第6,689,558號；第7,067,317號；第7,262,054；Perez-Pinera等(2013)Nature Methods 10:973–976；Platek等(2014)Plant Biotechnology J.doi:10.1111/pbi.12284)。使用這些含有鋅指蛋白的工程化轉(zhuǎn)錄因子的臨床試驗已表明，這些新型轉(zhuǎn)錄因子能夠治療各種病況。(見，例如，Yu等(2006)FASEB J.20:479-481)。另外，包含來自鋅指蛋白(“ZFP”)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、TAL-效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域(“TALE”)、Ttago和CRISPR/Cas或Ttago核酸酶系統(tǒng)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的人工核酸酶具有經(jīng)由基因的核酸酶介導(dǎo)的修飾(包括在非同源末端連接(NHEJ)后，同源性定向修復(fù)(HDR)，和/或通過在非同源末端連接(NHEJ)驅(qū)動的過程期間的末端捕獲)來修飾內(nèi)源基因的基因表達的能力。見，例如，8,623,618；8,034,598；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美國專利公開20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983；20130177960和20150056705，為了所有目的，所述專利或?qū)＠_的公開內(nèi)容通過引用其整體并入本文。因此，這些方法通常涉及使用工程化裂解系統(tǒng)來誘導(dǎo)靶DNA序列中的雙鏈斷裂(DSB)或切口，以使得通過錯誤產(chǎn)生過程諸如非同源末端連接(NHEJ)的斷裂的修復(fù)，或使用修復(fù)模板的修復(fù)(同源性定向修復(fù)或HDR)可導(dǎo)致基因的敲除或目標序列的插入(靶向整合)。在外部提供的修復(fù)模板(例如“供體”或“轉(zhuǎn)基因”)不存在的情況下引入雙鏈斷裂通常用于經(jīng)由通過細胞NHEJ途徑引入的突變(插入和/或缺失，稱為“插入缺失”)使靶基因失活。例如，美國專利公開20110082093公開了靶向Htt的特異性鋅指蛋白，美國專利公開第20130253040號涉及調(diào)節(jié)HD等位基因如Htt的表達的DNA結(jié)合蛋白。

然而，仍然需要用于診斷、研究、治療和/或預(yù)防亨廷頓病的方法，包括檢測mHTT以監(jiān)測疾病進展，用于增加對HD的神經(jīng)病理生物學(xué)的理解，以及評估疾病改善性HD療法。

概述

本文中公開了用于診斷和/或治療亨廷頓病的方法和組合物。具體地，本文提供了用于在患有HD的受試者中檢測、減少和/或消除Htt聚集物、改善運動缺陷、增加細胞活性(例如，ATP活性)和/或減少細胞凋亡的方法和組合物。

因此，在一個方面，本文描述了修飾患有HD的受試者中的神經(jīng)元的方法，所述方法包括向所述受試者施用突變型Htt等位基因的阻遏物，以使得神經(jīng)元被修飾。在某些實施方案，所述神經(jīng)元是包含突變型Htt等位基因和/或包含增加量的胞內(nèi)聚集的Htt(“HD神經(jīng)元”)的神經(jīng)元。在某些實施方案中，所述修飾包括減少神經(jīng)元(例如，HD神經(jīng)元)中Htt的聚集；增加神經(jīng)元(例如，HD神經(jīng)元)的能量代謝，例如通過升高細胞內(nèi)ATP水平；和/或降低神經(jīng)元(例如，HD神經(jīng)元)中對細胞凋亡的易感性。在某些實施方案中，所述受試者是哺乳動物。

因此，在其它方面，本文描述了防止和/或減少具有HD的受試者的HD神經(jīng)元中Htt聚集物形成的方法，所述方法包括向所述受試者施用突變型Htt等位基因的阻遏物。

在其它方面，本文描述了增加神經(jīng)元(例如，HD神經(jīng)元)中的細胞活性(例如，ATP活性)的方法，所述方法包括向所述神經(jīng)元施用突變型Htt等位基因的阻遏物。

在其它方面，本文描述了減少神經(jīng)元(例如，HD神經(jīng)元)中的細胞凋亡的方法，所述方法包括向所述神經(jīng)元施用突變型Htt等位基因的阻遏物。

在另一個方面，本文描述了通過向有此需要的受試者施用突變型Htt等位基因的阻遏物來減少所述有此需要的HD受試者的運動缺陷(例如，緊握)的方法。

在另一方面，本文描述了用于檢測受試者中(例如，在CSF中)的mHtt的方法，包括響應(yīng)于治療(例如，響應(yīng)于如本文所述的Htt阻遏物的施用)檢測mHtt。某些實施方案中，所述檢測涉及定量所述受試者中的mHtt的量。本文所述的任何檢測方法可用于HD的診斷和/或用于監(jiān)測疾病進展，因為mHTT水平與疾病負擔(dān)評分顯著相關(guān)，并且mHTT水平在濃度上隨著疾病進展而增加。此外，檢測(例如，定量)受試者中的mHtt的任何方法可用于評價HD的神經(jīng)病理生物學(xué)的方法和/或評價疾病改善性HD療法的功效。

在本文所述的任何方法中，突變型Htt等位基因的阻遏物可以是ZFP-TF，例如包含特異性結(jié)合突變型Htt等位基因的ZFP和轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(例如，KOX、KRAB等)的融合蛋白。在其它實施方案中，突變型Htt等位基因的阻遏物可以是TALE-TF，例如包含特異性結(jié)合突變型Htt等位基因的TALE多肽和轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(例如，KOX、KRAB等)的融合蛋白。在一些實施方案中，突變型Htt型等位基因阻遏物是CRISPR/Cas-TF，其中Cas蛋白中的核酸酶結(jié)構(gòu)域已被失活，以使得所述蛋白不再裂解DNA。將所得的Cas RNA引導(dǎo)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄阻遏物(例如，KOX、KRAB等)融合以抑制突變型Htt等位基因。在其它實施方案中，所述阻抑物可包含通過裂解突變型Htt等位基因并從而使其失活來抑制突變型Htt等位基因的核酸酶(例如，ZFN、TALEN和/或CRISPR/Cas系統(tǒng))。在某些實施方案中，核酸酶在通過核酸酶裂解后經(jīng)由非同源末端連接(NHEJ)引入插入和/或缺失(“插入缺失”)。在其它實施方案中，核酸酶引入供體序列(通過同源或非同源定向方法)，其中供體整合使突變型Htt等位基因失活。

在本文所述的任何方法中，可將所述阻遏物可以作為蛋白質(zhì)、多核苷酸或蛋白質(zhì)和多核苷酸的任何組合遞送至神經(jīng)元(例如，HD神經(jīng)元)。在某些實施方案中，使用表達構(gòu)建體例如質(zhì)粒或病毒載體(例如，慢病毒載體、腺病毒(Ad)載體、腺相關(guān)病毒(AAV)載體等)遞送所述阻遏物。在其它實施方案中，將所述阻遏物作為mRNA遞送。在其它實施方案中，使用本文所述的任何表達構(gòu)建體的組合(例如一個表達構(gòu)建體上的一個阻遏物(或其部分)和分開的表達構(gòu)建體上的一個阻遏物(或其部分))遞送所述阻遏物。

此外，在本文所述的任何方法中，所述阻遏物可以以提供所需作用的任何濃度(劑量)遞送。在某些實施方案中，所述阻遏物使用為250至1,000(或其間任何值)的MOI的慢病毒載體來進行遞送。在其它實施方案中，以150-1,500ng/100,000個細胞使用質(zhì)粒載體遞送所述阻遏物。在其它實施方案中，以10,000-500,000個載體基因組/細胞(或其間的任何值)使用腺相關(guān)病毒載體遞送所述阻遏物。在其它實施方案中，以150-1,500ng/100,000個細胞(或其間的任何值)將阻遏物作為mRNA進行遞送。

在本文所述的任何方法中，所述方法可在受試者的一個或多個HD神經(jīng)元中產(chǎn)生約85％或更大、約90％或更大、約92％或更大或約95％或更大的的突變型Htt等位基因的表達。

在另外的方面，本文所述的本發(fā)明包含一種或多種Htt-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，諸如包含鋅指蛋白(ZFP TF)、TALE(TALE-TF)和CRISPR/Cas-TF的一種或多種的Htt-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子例如ZFP-TF、TALE-TF或CRISPR/Cas-TF。在某些實施方案中，Htt-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子可在受試者的一個或多個HD神經(jīng)元中抑制突變型Htt等位基因的表達。所述抑制可以是相較于受試者的未處理的(野生型)神經(jīng)元，受試者的一個或多個HD神經(jīng)元中突變型Htt等位基因的約85％或更大、約90％或更大、約92％或更大或約95％或更大的抑制。在某些實施方案中，Htt-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子可用于實現(xiàn)本文所述的方法中的一個或多個。

還提供了包含一種或多種Htt-調(diào)節(jié)劑(例如，阻遏物)和/或包含本文所述的Htt-調(diào)節(jié)劑(或其組分)的組分和/或編碼其的多核苷酸的試劑盒。所述試劑盒還可包含細胞(例如，神經(jīng)元)、試劑(例如，用于檢測和/或定量例如CSF中的mHtt蛋白)和/或使用說明書，包括如本文所述的方法。

根據(jù)作為整體的公開內(nèi)容，這些和其它方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。

附圖簡述

圖1是描繪在向神經(jīng)元施用指定的構(gòu)建體后，HD神經(jīng)元(如所指示3個左側(cè)條塊)和非HD神經(jīng)元(如指示的3個右側(cè)條塊)的相對細胞內(nèi)ATP水平的圖。“33074”是指與轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(KOX)以及GFP編碼序列融合的包括ZFP 33074(表1A，其對突變型Htt是特異的)的ZFP-TF阻遏物；“GFP”是指僅編碼GFP(無ZFP-TF)的構(gòu)建體；以及“模擬物”指不含編碼序列的構(gòu)建體。

圖2是描繪在向神經(jīng)元施用指定的構(gòu)建體(參見圖1)后，通過TUNEL測定法測定的HD神經(jīng)元(如所指示的3個左側(cè)條塊)和非HD神經(jīng)元(如所指示的3個右側(cè)條塊)中的細胞凋亡細胞的百分比的圖。

圖3A至3K描繪了在用Htt突變型等位基因的ZFP-TF阻遏物處理后防止Q175小鼠中突變型Htt聚集。圖3A-3H顯示從用ZFP-TF表達構(gòu)建體處理的小鼠獲得的腦切片的免疫組織化學(xué)分析的代表性圖像。圖3A至3D顯示用標記核DNA的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和針對FLAG表位標簽的抗體(其指示ZFP-TF的存在)染色的圖像。ZFP-TF僅存在于其被施用的那側(cè)(同側(cè)的)。圖3E至3H顯示了利用針對突變型Htt聚集物的抗體(mEM48)染色后的代表性圖像。在未接受注射的對側(cè)紋狀體中，相較于經(jīng)由注射接受ZFP-TF表達構(gòu)建體的同側(cè)紋狀體(其中觀察到非常低水平的突變型Htt聚集)，通過mEM48抗體容易檢測到突變型Htt聚集。圖3I是顯示針對未用指定的構(gòu)建體注射的對側(cè)紋狀體中每細胞的聚集物的數(shù)目標準化的同側(cè)紋狀體中每細胞(如針對FLAG(+)和GFP(+)細胞定量的)的核Htt聚集物的數(shù)目的圖。圖3J是顯示針對來自對側(cè)紋狀體的神經(jīng)元中對于Htt聚集物的核mEM48染色的強度標準化的接受指定的構(gòu)建體的細胞中的所述染色強度的圖。圖3K是顯示針對對側(cè)紋狀體神經(jīng)元中的核周突變型Htt聚集物的密度標準化的ZFP-TF阻遏物或GFP表達細胞中的所述密度的圖。在圖3I至3K中，“GFP”是指編碼GFP但還編碼ZFP-TF Htt阻遏物的構(gòu)建體；“30640”和“30645”是指在注射構(gòu)建體中使用的具體ZFP設(shè)計(表1)。通過Kruskal Wallis檢驗和Dunn多重比較進行統(tǒng)計分析；*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001；數(shù)據(jù)顯示為具有平均值±SEM的條形圖。

圖4A至4D描繪了在用Htt突變型等位基因的ZFP-TF阻遏物處理后Q175小鼠中突變型Htt聚集的逆轉(zhuǎn)。圖4A顯示在對側(cè)和同側(cè)紋狀體中用DARPP-32(紋狀體特異性蛋白)和抗Htt聚集物抗體mEM48染色的ZFP-TF和對照動物腦切片的代表性圖像。圖4B是顯示針對未用指定的構(gòu)建體注射的對側(cè)紋狀體中每細胞的聚集物的數(shù)目標準化的同側(cè)紋狀體中每細胞(如針對FLAG(+)和GFP(+)細胞定量的)的核Htt聚集物的數(shù)目的圖。圖4C是顯示針對來自對側(cè)紋狀體的神經(jīng)元中的Htt聚集物的核mEM48染色的強度標準化的，接受指定構(gòu)建體的細胞中的所述染色強度的圖。圖4D是顯示針對對側(cè)紋狀體神經(jīng)元中的核周突變型Htt聚集物的密度標準化的，ZFP-TF阻遏物或GFP表達細胞中的所述聚集物密度的圖。在圖4B至4D中，“GFP”是指編碼GFP但還編碼ZFP-TF Htt阻遏物的構(gòu)建體；“GFP-2A-30640”和“GFP-2A-30645”是指編碼GFP和注射構(gòu)建體中使用的特定ZFP設(shè)計的構(gòu)建體(表1)。通過Kruskal Wallis檢驗和Dunn多重比較進行統(tǒng)計分析；*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001；數(shù)據(jù)顯示為具有平均值±SEM的條形圖。

圖5A至5C描述了注射AAV-ZFP-33074后防止Q175小鼠的紋狀體中突變型Htt聚集。將AAV載體在2月齡時遞送至紋狀體中，在4月齡時進行分析。圖5A是顯示在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的(用GFP標記的)中間棘神經(jīng)元(MSN，由DARPP32抗體標記的)中的核Htt聚集物的數(shù)量的圖。圖5B是顯示AAV-轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSN中的上突變型Htt聚集物的密度的圖。圖5C是顯示在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSN中針對htt聚集物染色的核mEM48抗體的強度的圖?！皩φ誂AV”是指表達GFP的AAV載體，“ZFP 33074”是指通過自裂解2A肽連接的表達ZFP 33074和GFP的AAV載體。數(shù)據(jù)顯示為具有平均值±SEM的點圖。使用Kruskal-Wallis檢驗和Dunn post檢驗(對比對照)進行統(tǒng)計分析；***＝p<0.001。對于每個組，使用4只動物中的n只，每只動物6個切片用于定量。

圖6A至6C描繪注射AAV-ZFP-33074后Q175小鼠的紋狀體中突變型Htt聚集的減少。將AAV載體在6月齡時遞送至紋狀體中，在10月齡時進行分析。圖6A是顯示AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的(用GFP標記的)中間棘神經(jīng)元神經(jīng)元(MSN，由DARPP32抗體標記的)中的核Htt聚集物的數(shù)量的圖。圖6B是顯示AAV-轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSN中的核外突變型Htt聚集物的密度的圖。圖6C是顯示在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSN中針對htt聚集物的核mEM48抗體染色的強度的圖?！皩φ誂AV”是指表達GFP的AAV載體，“ZFP 33074”是指通過自裂解2A肽連接的表達ZFP33074和GFP的AAV載體?！癦FPΔDBD”是指除缺少鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)外，與“ZFP 33074”類似的對照AAV載體。數(shù)據(jù)以具有平均值±SEM的點圖顯示。使用Kruskal-Wallis檢驗和Dunn post檢驗(對比對照)進行統(tǒng)計分析；***＝p<0.001；n.s.＝不顯著。對于每一組，使用4只動物中的n只，每只動物6個切片用于定量。

圖7A和7B描繪了注射AAV-ZFP-33074后Q175小鼠的紋狀體中通過免疫染色顯示的增加的DARPP32表達。將AAV載體在6月齡時遞送至紋狀體中，在10月齡時進行分析。圖7A顯示相較于同齡野生型小鼠，10月齡Q175小鼠中的DARPP32表達降低。圖7B顯示用用于ZFP 33074的AAV載體或?qū)φ誂AV載體處理的Q175紋狀體中的DARPP32水平?！皩φ誂AV”是指表達GFP的AAV載體，“ZFP 33074”是指通過自裂解2A肽連接的表達ZFP 33074和GFP的AAV載體?！癦FPΔDBD”是指除缺少鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)外，與“ZFP 33074”相似的對照AAV載體。數(shù)據(jù)顯示為具有平均值±SEM的點圖。使用Kruskal-Wallis檢驗和Dunn post檢驗(對比對照)進行統(tǒng)計分析；*＝p<0.05，***＝p<0.001；n.s.＝不顯著。對于每一組，使用4只動物中的n只，每只動物6個切片用于定量。

詳述

本文公開了用于檢測、監(jiān)測疾病進展，治療和/或預(yù)防亨廷頓病(HD)的組合物和方法。具體地，本文所述方法允許在患有HD的受試者中改變腦(例如，HD神經(jīng)元)，從而提供HD的療法。使用Htt-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，諸如包含鋅指蛋白(ZFP TF)、TALE(TALE-TF)或CRISPR/Cas-TF(例如抑制突變型Htt等位基因表達的ZFP-TF、TALE-TF或CRISPR/Cas-TF)的Htt-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，可以修飾HD受試者中的HD神經(jīng)元，以使得HD的效應(yīng)和/或癥狀得以減輕或消除，例如通過在HD受試者中減少HD神經(jīng)元中Htt的聚集，通過增加HD神經(jīng)元能量學(xué)(例如，升高ATP水平)，通過減少HD神經(jīng)元中的細胞凋亡和/或通過減少HD受試者中的運動缺陷。另外，本文所述的組合物和方法允許檢測患者樣品(例如，CSF)中的HD。檢測患者樣品中的mHtt水平可允許診斷HD；基于mHtt水平監(jiān)測疾病進展；以及允許評估HD療法。

一般性

除非另有所指，否則本文公開的方法的實踐以及組合物的制備和使用應(yīng)用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、計算化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA和相關(guān)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，這在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻中被充分解釋。見，例如Sambrook等，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989和第三版，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新；系列METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，第三版，Academic Press,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，第304卷，“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe，編輯),Academic Press,San Diego,1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第119卷，“Chromatin Protocols”(P.B.Becker，編輯)Humana Press,Totowa,1999.

定義

術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用，是指以線性或環(huán)狀構(gòu)象，以單鏈或雙鏈形式存在的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公開的目的，這些術(shù)語不應(yīng)被解釋為對聚合物的長度的限制。該術(shù)語可包括天然核苷酸的已知類似物，以及在堿基、糖和/或磷酸酯部分(例如，硫代磷酸酯主鏈)中被修飾的核苷酸。通常，特定核苷酸的類似物具有相同的堿基配對特異性；即，A的類似物將與T堿基配對。

術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。術(shù)語也用于其中一個或多個氨基酸是對應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類似物或經(jīng)修飾的衍生物的氨基酸聚合物。

“結(jié)合”是指大分子之間(例如，蛋白質(zhì)與核酸之間)的序列特異性非共價相互作用。并非結(jié)合相互作用的所有組分都需要是序列特異性的(例如，與DNA主鏈中的磷酸殘基的接觸)，只要作為整體的相互作用是序列特異性的。此類相互作用通常特征在于10^-6M^-1或更低的解離常數(shù)(K_d)?！坝H和力”是指結(jié)合的強度：增加的結(jié)合親和力與較低的K_d相關(guān)。

“結(jié)合蛋白”是能夠非共價地結(jié)合于另一分子的蛋白質(zhì)。結(jié)合蛋白可結(jié)合于例如DNA分子(DNA結(jié)合蛋白)、RNA分子(RNA結(jié)合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白結(jié)合蛋白)。在蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白的情況下，其可結(jié)合其自身(以形成同源二聚體，同源三聚體等)和/或其可結(jié)合不同蛋白質(zhì)或多種蛋白質(zhì)的一個或多個分子。結(jié)合蛋白可具有多于一種類型的結(jié)合活性。例如，鋅指蛋白具有DNA結(jié)合、RNA結(jié)合和蛋白結(jié)合活性。

“鋅指DNA結(jié)合蛋白”(或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)是以序列特異性方式通過一個或多個鋅指結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)或較大蛋白質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域，所述鋅指是結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)經(jīng)由鋅離子的配位來使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化的氨基酸序列的區(qū)域。術(shù)語鋅指DNA結(jié)合蛋白通常被縮寫為鋅指蛋白或ZFP。

“TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“TALE”是包含一個或多個TALE重復(fù)結(jié)構(gòu)域/單位的多肽。重復(fù)結(jié)構(gòu)域參與TALE對其同源靶DNA序列的結(jié)合。單個“重復(fù)單元”(也稱為“重復(fù)”)通常長度為33-35個氨基酸，并且與天然存在的TALE蛋白內(nèi)的其它TALE重復(fù)序列顯示至少一定的序列同源性。見，例如，美國專利第8,586,526號。

“TtAgo”是被認為參與基因沉默的原核Argonaute蛋白。TtAgo源自細菌嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)。見，例如，Swarts等(2014)Nature 507(7491):258-261,G.Sheng等，(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,652)?！癟tAgo系統(tǒng)”是所有需要的組分，包括例如用于通過TtAgo酶的裂解的引導(dǎo)DNA。“重組”是指在兩個多核苷酸之間交換遺傳信息的過程，包括但不限于通過非同源末端連接(NHEJ)的供體捕獲和同源重組。為了本公開的目的，“同源重組(HR)”是指例如在經(jīng)由同源定向修復(fù)機制修復(fù)細胞中的雙鏈斷裂時發(fā)生的此類交換的專門形式。該過程需要核苷酸序列同源性，使用“供體”分子對“靶”分子(即，經(jīng)歷雙鏈斷裂的分子)進行的模板修復(fù)，并且被不同地稱為“非交叉基因轉(zhuǎn)換”或“短段基因轉(zhuǎn)換”，因為其導(dǎo)致遺傳信息從供體轉(zhuǎn)移到靶。不希望受任何特定理論束縛，此類轉(zhuǎn)移可涉及在斷裂的靶與供體之間形成的異源雙鏈DNA的錯配校正和/或“合成依賴性鏈退火”，其中供體用于重新合成將成為靶的一部分的遺傳信息，和/或相關(guān)過程。此類專門的HR通常導(dǎo)致靶分子序列的改變，以使得供體多核苷酸的部分或全部序列并入靶多核苷酸中。

鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域或TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以被“工程化”以結(jié)合預(yù)定的核苷酸序列，例如經(jīng)由工程化(改變一個或多個氨基酸)天然存在的鋅指蛋白的識別螺旋區(qū)域或通過工程改造TALE蛋白的RVD。因此，工程化的鋅指蛋白或TALE是非天然存在的蛋白。用于工程化鋅指蛋白或TALE的方法的非限制性實例是設(shè)計和選擇?！霸O(shè)計的”鋅指蛋白或TALE是不存在于自然中的蛋白質(zhì)，其設(shè)計/組成主要來自合理標準。設(shè)計的合理標準包括應(yīng)用替代規(guī)則和計算機化算法處理存儲現(xiàn)有ZFP設(shè)計和結(jié)合數(shù)據(jù)的信息的數(shù)據(jù)庫中的信息?！斑x擇的”鋅指蛋白或TALE是在自然界中未發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，其產(chǎn)生主要來自經(jīng)驗方法，例如噬菌體展示、相互作用誘捕或雜交選擇。見，例如，美國專利8,586,526；6,140,081；6,453,242；6,746,838；7,241,573；6,866,997；7,241,574和6,534,261；也見WO 03/016496。

術(shù)語“序列”是指任何長度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是線性的、環(huán)狀的或分支的，并且可以是單鏈或雙鏈的。術(shù)語“供體序列”是指被插入基因組中的核苷酸序列。供體序列可具有任何長度，例如長度為2至10,000個核苷酸(或其間或其上的任何整數(shù)值)，優(yōu)選長度為約100至1,000個核苷酸(或其間任何整數(shù))，更優(yōu)選長度為約200至500個核苷酸。

“靶位點”或“靶序列”是限定結(jié)合分子將結(jié)合的核酸的一部分的核酸序列，只要存在足夠的結(jié)合條件即可。

“外源”分子是通常不存在于細胞中但可以通過一種或多種遺傳、生物化學(xué)或其它方法引入細胞的分子。相對于細胞的特定發(fā)育階段和環(huán)境條件確定“在細胞中的正常存在”。因此，例如，僅在肌肉的胚胎發(fā)育期間存在的分子是相對于成體肌細胞的外源分子。類似地，由熱休克誘導(dǎo)的分子是相對于非熱休克細胞的外源分子。外源分子可以包含例如功能失常的內(nèi)源分子的功能性形式或功能正常的內(nèi)源分子的功能失常形式。

外源分子可以是，除其它以外，小分子，諸如通過組合化學(xué)方法產(chǎn)生的小分子，或大分子諸如蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何經(jīng)修飾的衍生物，或包含上述分子的一個或多個的任何復(fù)合物。核酸包括DNA和RNA，可以是單鏈或雙鏈的；可以是線性的，分支的或環(huán)狀的；并且可具有任何長度。核酸包括能夠形成雙鏈體的核酸，以及形成三鏈體的核酸。見，例如，美國專利第5,176,996號和第5,422,251號。蛋白質(zhì)包括但不限于DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑因子、甲基化DNA結(jié)合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脫甲基酶、乙酰酯酶、脫乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓撲異構(gòu)酶、促旋酶和解螺旋酶。

外源分子可以是與內(nèi)源分子相同類型的分子，例如外源蛋白質(zhì)或核酸。例如，外源核酸可以包含被引入細胞的感染性病毒基因組、質(zhì)?；蚋郊芋w，或通常不存在于細胞中的染色體。將外源分子引入細胞的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，包括，但不限于脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(即，脂質(zhì)體，包括中性和陽離子脂質(zhì))、電穿孔、直接注射、細胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。外源分子也可以是與內(nèi)源分子相同類型但源自與細胞所源自的物種不同的物種的分子。例如，可將人核酸序列引入最初源自小鼠或倉鼠的細胞系中。

相比之下，“內(nèi)源”分子是在特定環(huán)境條件下在特定發(fā)育階段通常存在于特定細胞中的分子。例如，內(nèi)源核酸可以包含染色體、線粒體、葉綠體或其它細胞器的基因組或天然存在的附加體核酸。另外的內(nèi)源分子可以包括蛋白質(zhì)，例如，轉(zhuǎn)錄因子和酶。

“融合”分子是其中兩個或更多個亞基分子連接，優(yōu)選共價連接的分子。亞基分子可以是相同化學(xué)類型的分子，或可以是不同化學(xué)類型的分子。第一類型的融合分子的實例包括，但不限于融合蛋白(例如，ZFP或TALE DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一個或多個激活結(jié)構(gòu)域之間的融合體)和融合核酸(例如，編碼上文所述的融合蛋白的核酸)。第二類型的融合分子的實例包括，但不限于，形成三鏈體的核酸與多肽之間的融合，以及小溝結(jié)合劑與核酸之間的融合。

融合蛋白在細胞中的表達可由融合蛋白至細胞的遞送或通過將編碼融合蛋白的多核苷酸遞送至細胞而產(chǎn)生，其中所述多核苷酸被轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄物被翻譯以產(chǎn)生所述融合蛋白。反式剪接、多肽裂解和多肽連接也可以參與蛋白質(zhì)在細胞中的表達。將多核苷酸和多肽遞送至細胞的方法在本公開的其它地方提供。

“多聚化結(jié)構(gòu)域”(也稱為“二聚化結(jié)構(gòu)域”或“蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域”)是并入ZFP TF或TALE TF的氨基、羧基或氨基和羧基末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域允許多個ZFP TF或TALE TF單位的多聚化，以使得較大片段的三核苷酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域相對于具有野生型數(shù)目的長度的較短片段，優(yōu)先被多聚化的ZFP TF或TALE TF結(jié)合。多聚化結(jié)構(gòu)域的實例包括亮氨酸拉鏈。多聚化結(jié)構(gòu)域還可以通過小分子來調(diào)節(jié)，其中多聚化結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)正確構(gòu)象，以允許僅在小分子或外部配體存在的情況下與另一多聚化結(jié)構(gòu)域相互作用。這樣，外源配體可用于調(diào)節(jié)這些結(jié)構(gòu)域的活性。

為了本公開的目的，“基因”包括編碼基因產(chǎn)物(見下文)的DNA區(qū)域以及調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的所有DNA區(qū)域，無論此類調(diào)控序列是否與編碼序列和/或轉(zhuǎn)錄的序列相鄰。因此，基因包括，但不必限于啟動子序列、終止子、翻譯調(diào)控序列諸如核糖體結(jié)合位點和內(nèi)部核糖體進入位點、增強子、沉默子、絕緣子、邊界元件、復(fù)制起始點、基質(zhì)附著位點和基因座控制區(qū)。

“基因表達”是指包含在基因中的信息至基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化?；虍a(chǎn)物可以是基因的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義RNA、核酶、結(jié)構(gòu)RNA或任何其它類型的RNA)或通過翻譯mRNA產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?；虍a(chǎn)物還包括通過諸如加帽、多聚腺苷酸化、甲基化和編輯的過程修飾的RNA和通過例如甲基化、乙?；⒘姿峄?、遍在蛋白化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化和糖基化修飾的蛋白質(zhì)。

基因表達的“調(diào)節(jié)”是指基因活性的變化。表達的調(diào)節(jié)可包括，但不限于，基因激活和基因抑制?；蚪M編輯(例如，裂解、改變、失活、隨機突變)可用于調(diào)節(jié)表達?；蚴Щ钍侵赶噍^于不包括如本文所述的ZFP或TALE蛋白的細胞，基因表達的任何減少。因此，基因失活可以是部分或完全的。

“目標區(qū)域”是其中期望結(jié)合外源分子的細胞染色質(zhì)的任何區(qū)域，例如，基因或基因內(nèi)或與之鄰近的非編碼序列。結(jié)合可以是為了靶向DNA裂解和/或靶向重組的目的。目標區(qū)域可以例如存在于染色體、附加體、細胞器基因組(例如，線粒體、葉綠體)或感染性病毒基因組中。目標區(qū)域可存在于基因的編碼區(qū)內(nèi)、轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)例如例如前導(dǎo)序列、尾部序列或內(nèi)含子內(nèi)，或在非轉(zhuǎn)錄區(qū)(編碼區(qū)的上游或下游)內(nèi)。目標區(qū)域可以小至單個核苷酸對或長達2,000個核苷酸對，或任何核苷酸對的整數(shù)值。

“真核”細胞包括，但不限于，真菌細胞(諸如酵母)、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞和人細胞(例如，T細胞)。

術(shù)語“有效鍵聯(lián)”和“可操作地連接”(或“有效地連接”)就兩個或更多個組分(諸如序列元件)的并置而言可互換使用，其中這樣排列組分以使得兩個組分正常地起作用，并且使得所述組分中的至少一個有可能可以介導(dǎo)施加在至少一個另外的組分上的功能。作為說明，如果轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列響應(yīng)于一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的存在或不存在而控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄水平，則所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(例如啟動子)可操作地連接于編碼序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列通常與編碼序列以順式可操作地連接，但不需要與其直接相鄰。例如，增強子是可操作地連接于編碼序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，即使它們不是毗連的。

關(guān)于融合多肽，術(shù)語“可操作地連接”可指這樣的事實：每個組分與另一個組分連接時執(zhí)行與當其不這樣連接時其可執(zhí)行的功能相同的功能。例如，對于其中ZFP或TALE DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合于激活結(jié)構(gòu)域的融合多肽，如果在融合多肽中ZFP或TALE DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點和/或其結(jié)合位點，而激活結(jié)構(gòu)域能夠上調(diào)基因表達，則所述ZFP或TALE DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域與激活結(jié)構(gòu)域處于有效鍵聯(lián)中。與能夠調(diào)節(jié)基因表達的結(jié)構(gòu)域融合的ZFP統(tǒng)稱為“ZFP-TF”或“鋅指轉(zhuǎn)錄因子”，而與能夠調(diào)節(jié)基因表達的結(jié)構(gòu)域融合的TALE統(tǒng)稱為“TALE-TF”或“TALE轉(zhuǎn)錄因子”。當為其中ZFP DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合于裂解結(jié)構(gòu)域(“ZFN”或“鋅指核酸酶”)的融合多肽時，如果在所述融合多肽中，ZFP DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點和/或其結(jié)合位點，而裂解結(jié)構(gòu)域能夠裂解靶位點附近的DNA，則所述ZFP DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域處于有效鍵聯(lián)中。當為其中TALE DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合于裂解結(jié)構(gòu)域(“TALEN”或“TALE核酸酶”)的融合多肽時，如果在所述融合多肽時，TALE DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點和/或其結(jié)合位點，而裂解結(jié)構(gòu)域能夠裂解靶位點附近的DNA，則TALE DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和裂解結(jié)構(gòu)域處有效鍵聯(lián)中。關(guān)于其中Cas DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合于激活結(jié)構(gòu)域的融合多肽，如果在所述融合多肽中，Cas DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點和/或其結(jié)合位點，而激活域能夠上調(diào)基因表達，則Cas DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域處于有效鍵聯(lián)中。當為其中Cas DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合于裂解結(jié)構(gòu)域的融合多肽時，如果在所述融合多肽中，Cas DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合其靶位點和/或其結(jié)合位點，而裂解結(jié)構(gòu)域能夠裂解靶位點附近的DNA，則Cas DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與裂解結(jié)構(gòu)域處于有效鍵聯(lián)中。

蛋白質(zhì)、多肽或核酸的“功能性片段”是其序列與全長蛋白質(zhì)、多肽或核酸不同但仍保持與全長蛋白質(zhì)、多肽或核酸相同的功能的蛋白質(zhì)，多肽或核酸。功能性片段可具有與對應(yīng)天然分子相比更多、更少或相同數(shù)目的殘基，和/或可含有一個或多個氨基酸或核苷酸取代。用于測定核酸的功能(例如，編碼功能，與另一核酸雜交的能力)的方法在本領(lǐng)域中是公知知的。類似地，用于測定蛋白質(zhì)功能的方法是公知的。例如，可以例如通過過濾結(jié)合、電泳遷移率變動或免疫沉淀測定來測定多肽的DNA結(jié)合功能。DNA裂解可通過凝膠電泳來測定。見Ausubel等，同上。蛋白質(zhì)與另一種蛋白質(zhì)相互作用的能力可以例如通過共免疫沉淀、雙雜交測定或互補(遺傳和生物化學(xué))來測定。見，例如，F(xiàn)ields等(1989)Nature340:245-246；美國專利第5,585,245號和PCT WO 98/44350。

“載體”能夠?qū)⒒蛐蛄修D(zhuǎn)移至靶細胞。通常地，“載體構(gòu)建體”、“表達載體”和“基因轉(zhuǎn)移載體”是指能夠指導(dǎo)目標基因表達并且可將基因序列轉(zhuǎn)移至靶細胞的任何核酸構(gòu)建體。因此，術(shù)語包括克隆性和表達載體，以及整合載體。

“報告基因”或“報告序列”是指產(chǎn)生易于優(yōu)選但不一定在常規(guī)測定中測量的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的任何序列。合適的報告基因包括，但不限于，編碼介導(dǎo)抗生素抗性(例如，氨芐青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白質(zhì)的序列、編碼有色或熒光或發(fā)光蛋白(例如，綠色熒光蛋白、增強綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶)的序列和介導(dǎo)增強的細胞生長和/或基因擴增的蛋白(例如，二氫葉酸還原酶)。表位標簽包括，例如，一個或多個拷貝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可檢測的氨基酸序列?！氨磉_標簽”包括編碼報告分子的序列，所述報告子可被可操作地連接于所需的基因序列，以便監(jiān)測目標基因的表達。

DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域

本文所述的方法利用組合物，例如Htt-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，其包含特異性結(jié)合Htt基因中的靶序列，特別是結(jié)合突變型Htt等位基因的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述突變型Htt等位基因包含多個三核苷酸重復(fù)。任何DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域都可用于本文公開的組合物和方法中。

在某些實施方案中，Htt-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子或其中的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含鋅指蛋白。靶位點的選擇；用于設(shè)計和構(gòu)建融合蛋白(和編碼其的多核苷酸)的ZFP和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且詳細地描述于美國專利第6,140,081號；第5,789,538號；第6,453,242號；第6,534,261號；第5,925,523號；第6,007,988號；第6,013,453號；第6,200,759號；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO03/016496中。

在某些實施方案中，ZFP可選擇性地結(jié)合突變型Htt等位基因或野生型Htt序列。Htt靶位點通常包括至少一個鋅指，但可包括多個鋅指(例如，2個、3個、4個、5個、6個或更多個鋅指)。通常，ZFP包括至少3個指。某些ZFP包括4個、5個或6個指，而一些ZFP包括8個、9個、10個、11個或12個指。包括3個指的ZFP通常識別包括9個或10個核苷酸的靶位點；包括4個指的ZFP通常識別包括12個至14個核苷酸的靶位點；而具有6個指的ZFP可識別包括18個至21個核苷酸的靶位點。ZFP還可以是包括一個或多個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述結(jié)構(gòu)域可以是轉(zhuǎn)錄激活或抑制結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，所述融合蛋白包含連接在一起的兩個ZFP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，這些鋅指蛋白可包含8個、9個、10個、11個、12個或更多個指。在一些實施方案中，兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域經(jīng)由可延伸的柔性接頭連接，以使得一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含4個、5個或6個鋅指，并且第二DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含另外的4個、5個或5個鋅指。在一些實施方案中，接頭是標準指間接頭，以使得指陣列包含一個包含8個、9個、10個、11個或12個或更多個指的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在其它實施方案中，接頭是非典型接頭，例如柔性接頭。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合于至少一個調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域并且可以被認為是‘ZFP-ZFP-TF’結(jié)構(gòu)。這些實施方案的具體實例可被稱為“ZFP-ZFP-KOX”，其包含與柔性接頭連接并與KOX阻遏子融合的兩個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和“ZFP-KOX-ZFP-KOX”，其中兩個ZFP-KOX融合蛋白經(jīng)由接頭融合在一起。

或者，DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可源自核酸酶。例如，歸巢內(nèi)切核酸酶和大范圍核酸酶的識別序列諸如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII是已知的。也見美國專利第5,420,032號；美國專利第6,833,252號；Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–3388；Dujon等(1989)Gene 82:115–118；Perler等(1994)Nucleic Acids Res.22,1125–1127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224–228；Gimble等(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argast等(1998)J.Mol.Biol.280:345–353以及New England Biolabs目錄。另外，歸巢內(nèi)切核酸酶和大范圍核酸酶的DNA結(jié)合特異性可被工程化來結(jié)合非天然靶位點。見，例如，Chevalier等(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962；Ashworth等(2006)Nature441:656-659；Paques等(2007)Current Gene Therapy 7:49-66；美國專利公開第20070117128號。

“雙手”鋅指蛋白是其中兩個鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的簇通過插入氨基酸分開，以使得兩個鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合兩個不連續(xù)的靶位點的那些蛋白。雙手類型的鋅指結(jié)合蛋白的實例是SIP1，其中4個鋅指的簇位于蛋白的氨基末端，3個指的簇位于羧基末端(見Remacle等，(1999)EMBO Journal 18(18):5073-5084)。這些蛋白中的每個鋅指簇能夠結(jié)合獨特的靶序列，并且兩個靶序列之間的間隔可包含許多核苷酸。雙手ZFP可以包括例如與一個或兩個ZFP融合的功能結(jié)構(gòu)域。因此，顯而易見的是，可將功能結(jié)構(gòu)域附接于一個或兩個ZFP的外部(見圖1C)或可位于ZFP之間(附接于兩個ZFP)(見圖4)。

Htt-靶向的ZFP的具體實例公開于美國專利公開第20130253040號(出于所有目的，所述美國專利公開通過引用整體并入本文)以及下表1中。該表中的第一列是用于ZFP的內(nèi)部參照名稱(編號)，并且對應(yīng)于表2的第1列中的相同名稱?！癋”是指指，并且“F”之后的數(shù)字是指哪個鋅指(例如，“F1”是指指1)。

表1:Htt-靶向的鋅指蛋白

這些蛋白的靶位點的序列和位置公開于表2中。由ZFP識別螺旋接觸的靶位點中的核苷酸以大寫字母標示；非接觸核苷酸以小寫字母標示。

表2：人和小鼠Htt上的靶位點

在某些實施方案中，所述DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)TAL效應(yīng)子(TALE)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。見，例如，美國專利第8,586,526號，通過引用整體并入本文。

已知黃單胞菌屬(Xanthomonas)的植物病原細菌在重要的作物植物中引起許多疾病。黃單胞菌屬的致病性取決于保守的III型分泌(T3S)系統(tǒng)，其將超過25種不同的效應(yīng)子蛋白注射至植物細胞中。在這些注射的蛋白質(zhì)中有轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)子(TALE)，其模擬植物轉(zhuǎn)錄激活物并操縱植物轉(zhuǎn)錄組(見Kay等(2007)Science 318:648-651)。這些蛋白質(zhì)含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。最充分表征的TALE之一是來自野油菜黃單胞菌辣椒點病(Xanthomonas campestgris pv.Vesicatoria)的AvrBs3(見Bonas等(1989)Mol Gen Genet 218:127-136和WO2010079430)。TALE含有串聯(lián)重復(fù)的集中結(jié)構(gòu)域，每個重復(fù)含有大約34個氨基酸，這對于這些蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合特異性是至關(guān)重要的。此外，它們含有核定位序列和酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(關(guān)于綜述，見Schornack S等(2006)J Plant Physiol 163(3):256-272)。另外，在植物病原細菌青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)稱為brg11和hpx17的兩個基因與青枯雷爾氏菌生物變種1(R.solanacearum biovar 1)菌株GMI1000中和生物變種4菌株RS1000中的黃單胞菌屬的AvrBs3家族同源(見Heuer等(2007)Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384)。這些基因在核苷酸序列上彼此之間具有98.9％相一性，但相異在于hpx17的重復(fù)結(jié)構(gòu)域中的1,575bp的缺失。然而，兩種基因產(chǎn)物均與黃單胞菌屬的AvrBs3家族蛋白具有小于40％的序列同一性。

這些TALE的特異性取決于在串聯(lián)重復(fù)中發(fā)現(xiàn)的序列。重復(fù)序列包含約102bp，并且重復(fù)序列通常彼此具有91-100％的同源性(Bonas等，同上)。重復(fù)序列的多態(tài)性通常位于12和13位上，并且似乎在12和13位上的高可變雙殘基的種類與TALE的靶序列中連續(xù)核苷酸的種類之間存在一一對應(yīng)(見Moscou和Bogdanove(2009)Science326:1501和Boch等(2009)Science 326:1509-1512)。在實驗上已確定這些TALE的DNA識別編碼，以使得12和13位上的HD序列導(dǎo)致結(jié)合胞嘧啶(C)，NG結(jié)合T，NI結(jié)合A、C、G或T，NN結(jié)合A或G，以及NG結(jié)合T。這些DNA結(jié)合重復(fù)已被組裝成具有新的重復(fù)的組合和數(shù)量的蛋白質(zhì)，以制備能夠與新序列相互作用的人工轉(zhuǎn)錄因子。另外，美國專利第8,586,526號和美國公開第20130196373號(通過引用整體并入本文)描述了具有N-帽多肽、C帽多肽(例如，+63、+231或+278)和/或新型(非典型)RVD的TALE。

示例性TALE描述于美國專利公開第20130253040號(其通過引用整體并入)和下面的表3中。

所測試的TALE TF的目標和數(shù)字標識符示于下面的表3中。數(shù)字標識符標記為“SBS#”，指示了對于有義或反義鏈的特異性(“S/A”)，以及靶、重復(fù)單元或RVD的數(shù)目和C-末端的類型。

表3：Htt特異性TALE-TF

在某些實施方案中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括二聚化和/或多聚化結(jié)構(gòu)域，例如卷曲螺旋(CC)和二聚化鋅指(DZ)。見美國專利公開第20130253040號。

最近已出現(xiàn)在古細菌和許多細胞中存在RNA介導(dǎo)的基因組防御途徑的令人信服的證據(jù)，所述細菌已被假設(shè)與真核RNAi途徑平行(觀于綜述，見Godde和Bickerton、2006.J.Mol.Evol.62:718-729；Lillestol等，2006.Archaea 2:59-72；Makarova等，2006.Biol.Direct 1:7.；Sorek等，2008.Nat.Rev.Microbiol.6:181-186)。稱為CRISPR-Cas系統(tǒng)或原核RNAi(pRNAi)的該途徑被提議從兩個進化上和通常物理連接的基因座產(chǎn)生：CRISPR(成簇的規(guī)律間隔性短回文重復(fù))基因座，其編碼系統(tǒng)的RNA組分，和cas(CRISPR相關(guān)的)基因座，其編碼蛋白質(zhì)(Jansen等，2002.Mol.Microbiol.43:1565-1575；Makarova等，2002.Nucleic Acids Res.30:482-496；Makarova等，2006.Biol.Direct 1:7；Haft等，2005.PLoS Comput.Biol.1:e60)。微生物宿主中的CRISPR基因座含有CRISPR相關(guān)(Cas)基因以及能夠?qū)RISPR介導(dǎo)的核酸裂解的特異性編程的非編碼RNA元件的組合。單個Cas蛋白與真核RNAi機制的蛋白質(zhì)組分不共有顯著的序列相似性，但具有類似的預(yù)測的功能(例如，RNA結(jié)合、核酸酶、解旋酶等)(Makarova等，2006.Biol.Direct 1:7)。CRISPR相關(guān)(cas)基因通常與CRISPR重復(fù)間隔區(qū)陣列相關(guān)聯(lián)。已經(jīng)描述了超過40個不同的Cas蛋白家族。在這些蛋白家族中，Cas1似乎在不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)中普遍存在。已經(jīng)使用cas基因和重復(fù)結(jié)構(gòu)的特定組合來定義8種CRISPR亞型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中一些與編碼重復(fù)相關(guān)神秘蛋白(RAMP)的另外的基因模塊相關(guān)。多于一種CRISPR亞型可存在于單個基因組中。CRISPR/Cas亞型的零星分布表明該系統(tǒng)在微生物進化過程中經(jīng)歷水平基因轉(zhuǎn)移。

最初在化膿性鏈球菌(S.pyogenes)中描述的II型CRISPR是被最充分表征的系統(tǒng)之一，并且在四個連續(xù)步驟中進行靶向DNA雙鏈斷裂。首先，兩個非編碼RNA，前-crRNA陣列和tracrRNA，從CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄。第二，tracrRNA與前-crRNA的重復(fù)區(qū)雜交并介導(dǎo)前-crRNA至含單個間隔區(qū)序列的成熟crRNA的加工，其中在Cas9蛋白存在的情況下通過雙鏈特異性RNA酶III進行加工。第三，成熟的crRNA:tracrRNA復(fù)合物經(jīng)由crRNA上的間隔區(qū)與鄰近前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)的靶DNA上的前間區(qū)序列之間的沃爾森-克里克堿基配對將Cas9導(dǎo)向靶DNA，靶識別的另外要求。另外，tracrRNA也必須存在，因為其與crRNA在其3'末端堿基配對，并且該締合觸發(fā)Cas9活性。最后，Cas9介導(dǎo)靶DNA裂解以在前間區(qū)序列內(nèi)產(chǎn)生雙鏈斷裂。CRISPR/Cas系統(tǒng)的活性由三個步驟組成：(i)將外來DNA序列插入CRISPR陣列以在稱為“適應(yīng)”的過程中防止未來攻擊，(ii)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達，以及陣列的表達和加工，隨后是(iii)RNA介導(dǎo)的對外來核酸的干擾。因此，在細菌細胞中，幾種所謂的‘Cas’蛋白參與CRISPR/Cas系統(tǒng)的天然功能。

在許多不同的細菌中發(fā)現(xiàn)了II型CRISPR系統(tǒng)。由Fonfara等((2013)Nuc Acid Res 42(4):2377-2590)對公眾可獲得的基因組進行的BLAST搜索，在347種細菌中發(fā)現(xiàn)了Cas9的直向同源物。另外，該研究小組展示了使用來自化膿性鏈球菌、變形鏈球菌(S.mutans)、嗜熱鏈球菌(S.therophilus)、空腸彎曲菌(C.jejuni)、腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitides)、多殺巴氏桿菌(P.multocida)和新兇手弗朗西絲菌(F.novicida)的Cas9直向同源物進行的DNA靶的體外CRISPR/Cas裂解。因此，術(shù)語“Cas9”是指包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域的RNA引導(dǎo)的DNA核酸酶，其中編碼Cas9的基因可以源自任何合適的細菌。

Cas9蛋白具有至少兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域：一個核酸酶結(jié)構(gòu)域類似于HNH內(nèi)切核酸酶，而另一個類似于Ruv內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域。HNH型結(jié)構(gòu)域似乎負責(zé)裂解與crRNA互補的DNA鏈，而Ruv結(jié)構(gòu)域裂解非互補鏈。可對Cas9核酸酶進行工程化，以使得所述核酸酶結(jié)構(gòu)域中僅有一個具有功能性，產(chǎn)生Cas切口酶(見Jinek等，同上)。可通過在酶的催化結(jié)構(gòu)域中進行特定的氨基酸突變，或通過截短所述結(jié)構(gòu)域的部分或全部(以使得其不再具有功能)來產(chǎn)生切口酶。由于Cas 9包含兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，所以該方法可在任一結(jié)構(gòu)域上進行。通過使用兩種這樣的Cas 9切口酶可在靶DNA中實現(xiàn)雙鏈斷裂。切口酶將各自裂解DNA的一條鏈，并且兩種Cas 9切口酶的使用將產(chǎn)生雙鏈斷裂。

可通過使用包含通常由crRNA和tracrRNA退火形成的發(fā)夾的工程化“單引導(dǎo)RNA”(sgRNA)來避免對crRNA-tracrRNA復(fù)合物的需要(見Jinek等(2012)Science 337:816和Cong等(2013)Sciencexpress/10.1126/science.1231143)。在致熱螺旋體(S.pyrogenes)中，當雙鏈RNA:DNA異二聚體在Cas相關(guān)RNA與靶DNA之間形成時，工程化的tracrRNA:crRNA融合物或sgRNA引導(dǎo)Cas9裂解靶DNA。包含Cas9蛋白和含有PAM序列的工程化sgRNA的該系統(tǒng)已用于RNA引導(dǎo)的基因組編輯(見Ramalingam，同上)，并且已經(jīng)用于體內(nèi)斑馬魚胚胎基因組編輯(見Hwang等(2013)Nature Biotechnology31(3):227)，編碼效率與ZFN和TALEN相似。

CRISPR基因座的初級產(chǎn)物似乎是包含入侵者靶向序列的短RNA，并且基于它們在途徑中的假設(shè)作用被稱為引導(dǎo)RNA或原核沉默RNA(psiRNA)(Makarova等，2006.Biol.Direct 1:7；Hale等，2008.RNA,14:2572-2579)。RNA分析表明，CRISPR基因座轉(zhuǎn)錄物在重復(fù)序列內(nèi)被裂解以釋放含有單個侵入物靶向序列的約60至70-nt RNA中間體，以及側(cè)翼重復(fù)片段(Tang等2002.Proc.Natl.Acad.Sci.99:7536-7541；Tang等，2005.Mol.Microbiol.55:469-481；Lillestol等2006.Archaea 2:59-72；Brouns等2008.Science 321:960-964；Hale等，2008.RNA,14:2572-2579)。在古細菌激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)中，這些中間體RNA被進一步加工成豐富、穩(wěn)定的約35-45-nt的成熟psiRNA(Hale等2008.RNA,14:2572-2579)。

可通過使用包含通常通過crRNA與tracrRNA的退火形成的發(fā)夾的工程化“單引導(dǎo)RNA”(sgRNA)，來避免對crRNA-tracrRNA復(fù)合物的需求(參見Jinek等(2012)Science 337:816和Cong等(2013)Sciencexpress/10.1126/science.1231143)。在致熱螺旋體中，當雙鏈RNA:DNA異二聚體在Cas相關(guān)RNA與靶DNA之間形成時，工程化的tracrRNA:crRNA融合物或sgRNA引導(dǎo)Cas9裂解靶DNA。包含Cas9蛋白和含有PAM序列的工程化的sgRNA的該系統(tǒng)已經(jīng)用于RNA引導(dǎo)的基因組編輯(參見Ramalingam，同上)，并且已經(jīng)用于體內(nèi)斑馬魚胚胎基因組編輯(參見Hwang等(2013)Nature Biotechnology31(3):227)，其編輯效率與ZFN和TALEN相似。

嵌合或sgRNA可被工程化以包含與任何所需靶互補的序列。在一些實施方案中，引導(dǎo)序列長度為約或大于約5個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、35個、40個、45個、50個、75個或更多個核苷酸。在一些實施方案中，引導(dǎo)序列的長度小于約75個、50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、15個、12個或更少的核苷酸。在一些實施方案中，RNA包含與靶序列互補的22個堿基，和形式G[n19]的堿基，接著用于與化膿性鏈球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)一起使用的形式NGG或NAG的前間區(qū)序列鄰近基序(PAM)。因此，在一種方法中，可通過以下步驟利用目標基因中的已知的ZFN靶來設(shè)計sgRNA：(i)將ZFN異源二聚體的識別序列與相關(guān)基因組(人、小鼠或特定植物物種的)的參照序列進行比對；(ii)鑒定ZFN半位點之間的間隔區(qū)；(iii)鑒定最接近間隔區(qū)的基序G[N20]GG的位置(當多于一個此類基序列與間隔區(qū)重疊時，選擇相對于間隔區(qū)居中的基序)；(iv)使用該基序作為sgRNA的核心。該方法有利地依賴于證實的核酸酶靶。或者，可設(shè)計sgRNA以簡單地通過鑒定符合G[n20]GG式的合適的靶序列來靶向任何目標區(qū)域。與互補區(qū)一起，sgRNA可包含額外的核苷酸以延伸至sgRNA的tracrRNA部分的尾部區(qū)域(見Hsu等(2013)Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647)。尾部可具有+67至+85個核苷酸，或其間任何數(shù)目，優(yōu)選長度為+85個核苷酸。也可以使用截短的sgRNA，“tru-gRNA”(見Fu等，(2014)Nature Biotech 32(3):279)。在tru-gRNA中，互補區(qū)被減少至長度為17個或18個核苷酸。

另外，還可使用可選擇的PAM序列，其中PAM序列可以是作為NGG的替代物的NAG(Hsu 2014，同上)，使用化膿性鏈球菌Cas9。另外的PAM序列還可包括缺少初始G的那些PAM序列(Sander和Joung(2014)Nature Biotech 32(4):347)。除了化膿性鏈球菌編碼的Cas9PAM序列以外，還可使用對于來自其它細菌來源的Cas9蛋白是特異的其它PAM序列。例如，下面顯示的PAM序列(改編自Sander和Joung，同上和Esvelt等(2013)Nat Meth 10(11):1116)對于這些Cas9蛋白質(zhì)是特異性的：

因此，可以根據(jù)以下準則：[n17，n18，n19或n20](G/A)G選擇與化膿性鏈球菌CRISPR/Cas系統(tǒng)一起使用的合適的靶序列?；蛘?，PAM序列可遵循準則G[n17，n18，n19，n20](G/A)G。對于源自非化膿性鏈球菌細菌的Cas9蛋白，可使用相同的指導(dǎo)原則，其中替代PAM被替代為化膿性鏈球菌PAM序列。

最優(yōu)選的是選擇具有最高避免潛在脫靶序列的特異性的可能性的靶序列。這些不希望的脫靶序列可通過考慮以下屬性來鑒定：i)靶序列中的相似性，所述靶序列之后是已知與正在使用的Cas9蛋白一起作用的PAM序列；ii)與所需靶序列具有少于3個錯配的相似靶序列；iii)如ii)中的相似靶序列，其中所述錯配均位于PAM遠端區(qū)而不是PAM近端區(qū)(一些證據(jù)表明，緊鄰或鄰近PAM的核苷酸1-5，有時被稱為“種子”區(qū)域(Wu等(2014)Nature Biotech doi:10.1038/nbt2889)是對于識別最關(guān)鍵的，因此具有位于種子區(qū)域中的錯配的假定脫靶位點可能是最不可能被sg RNA識別的)；和iv)其中錯配被不連續(xù)地間隔或間隔大于4個核苷酸(Hsu 2014，同上)的相似靶序列。因此，通過使用上述這些標準，對將對其應(yīng)用任何CRIPSR/Cas系統(tǒng)的基因組中的潛在脫靶位點的數(shù)目進行分析，可鑒定sgRNA的合適的靶序列。

在某些實施方案中，Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白的“功能性衍生物”。天然序列多肽的“功能性衍生物”是具有與天然序列多肽相同的定性生物學(xué)性質(zhì)的化合物?！肮δ苄匝苌铩卑ǖ幌抻谔烊恍蛄械钠魏吞烊恍蛄卸嚯募捌淦蔚难苌?，條件是它們具有與對應(yīng)的天然序列多肽共同的生物活性。本文考慮的生物活性是功能性衍生物將DNA底物水解成片段的能力。術(shù)語“衍生物”涵蓋多肽的氨基酸序列變體、共價修飾及其融合物。在一些方面，功能性衍生物可包含天然存在的Cas蛋白的單一生物學(xué)特性。在其他方面，功能性衍生物可包含一個亞組的天然存在的Cas蛋白的生物學(xué)性質(zhì)。Cas多肽或其片段的合適衍生物包括但不限于Cas蛋白或其片段的突變體，融合物，共價修飾。Cas蛋白，其包括Cas蛋白或其片段，以及Cas蛋白或其片段的衍生物，可從細胞獲得或化學(xué)合成或通過這兩種方法的組合獲得。細胞可以是天然產(chǎn)生Cas蛋白的細胞，或天然產(chǎn)生Cas蛋白，并且被遺傳工程化以在更高的表達水平產(chǎn)生內(nèi)源Cas蛋白，或從外源引入的核酸產(chǎn)生Cas蛋白的細胞，所述核酸酸編碼與內(nèi)源性Cas相同或不同的Cas。在一些情況下，細胞不天然產(chǎn)生Cas蛋白，并且被遺傳工程化以產(chǎn)生Cas蛋白。

靶向特定基因的示例性CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)例如在美國臨時申請第61/823,689號中被公開。

因此，核酸酶包含與裂解DNA的核酸酶結(jié)構(gòu)域組合的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合任何希望插入供體的基因(轉(zhuǎn)基因)中的靶位點。

融合分子

DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與任何另外的分子(例如，多肽)融合以用于本文所述的方法中。在某些實施方案中，所述方法使用包含至少一種DNA結(jié)合分子(例如，ZFP、TALE或單引導(dǎo)RNA)和異源調(diào)節(jié)(功能性)結(jié)構(gòu)域(或其功能性片段)的融合分子。

在某些實施方案中，功能性結(jié)構(gòu)域包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。共同結(jié)構(gòu)域包括例如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域(激活物、阻遏物、共激活物、共阻遏物)、沉默子、致癌基因(例如，myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mos家族成員等)；DNA修復(fù)酶及其相關(guān)因子和修飾物；DNA重排酶及其相關(guān)因子和修飾物；染色質(zhì)相關(guān)蛋白及其修飾物(例如激酶、乙酰酯酶和脫乙酰酶)；和DNA修飾酶(例如，甲基轉(zhuǎn)移酶、拓撲異構(gòu)酶、解旋酶、連接酶、激酶、磷酸酶、聚合酶、內(nèi)切核酸酶)及其相關(guān)因子和修飾物。見，例如，美國公開第20130253040號，將其通過引用整體并入本文。

用于實現(xiàn)激活的合適的結(jié)構(gòu)域包括HSV VP16激活結(jié)構(gòu)域(見，例如Hagmann等，J.Virol.71,5952-5962(1997))、核激素受體(見，例如，Torchia等，Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亞基(Bitko&Barik，J.Virol.72:5610-5618(1998)和Doyle&Hunt,Neuroreport 8:2937-2942(1997))；Liu等，Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))，或人工嵌合功能性結(jié)構(gòu)域諸如VP64(Beerli等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623-33)和降解單元(Molinari等，(1999)EMBO J.18,6439-6447)。另外的示例激活結(jié)構(gòu)域包括Oct 1、Oct-2A、Sp1、AP-2和CTF1(Seipel等，EMBO J.11,4961-4968(1992)以及p300、CBP、PCAF、SRC1、PvALF、AtHD2A和ERF-2。見，例如，Robyr等(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347；Collingwood等(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255-275；Leo等(2000)Gene 245:1-11；Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77-89；McKenna等(1999)J.Steroid Biochem.Mol.Biol.69:3-12；Malik等(2000)Trends Biochem.Sci.25:277-283；和Lemon等(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。另外的示例性激活結(jié)構(gòu)域包括，但不限于OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5,-6,-7和-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP和TRAB1。見，例如，Ogawa等(2000)Gene 245:21-29；Okanami等(1996)Genes Cells 1:87-99；Goff等(1991)Genes Dev.5:298-309；Cho等(1999)Plant Mol.Biol.40:419-429；Ulmason等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849；Sprenger-Haussels等(2000)Plant J.22:1-8；Gong等(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44；和Hobo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348-15,353。

示例性抑制結(jié)構(gòu)域包括但不限于，KRAB A/B、KOX、TGF-β誘導(dǎo)型早期基因(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT家族的成員(例如，DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、Rb和MeCP2。見，例如，Bird等(1999)Cell 99:451-454；Tyler等(1999)Cell 99:443-446；Knoepfler等(1999)Cell 99:447-450；和Robertson等(2000)Nature Genet.25:338-342。另外的示例性抑制結(jié)構(gòu)域包括但不限于，ROM2和AtHD2A。見，例如，Chem等(1996)Plant Cell 8:305-321；和Wu等(2000)Plant J.22:19-27。

通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的克隆和生化綴合方法構(gòu)建融合分子。融合分子包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域(例如，轉(zhuǎn)錄激活或抑制結(jié)構(gòu)域)。融合分子還任選地包含核定位信號(諸如，例如，來自SV40培養(yǎng)基T-抗原的核定位信號)和表位標簽(諸如，例如，F(xiàn)LAG和血凝素)。設(shè)計融合蛋白(和編碼它們的核酸)，以使得翻譯閱讀框架保留在融合物的組分中。

一方面功能性結(jié)構(gòu)域(或其功能性片段)的多肽組分與另一方面的非蛋白質(zhì)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，抗生素、嵌入劑、小溝結(jié)合劑、核酸)之間的融合，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的生物化學(xué)綴合方法構(gòu)建。見，例如，the Pierce Chemical Company(Rockford、IL)目錄。已經(jīng)描述了用于制備小溝結(jié)合劑與多肽之間的融合物的方法和組合物。Mapp等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3930-3935。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可將融合分子與藥學(xué)上可接受的載體一起配制。見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，1985；和共同擁有的WO 00/42219。

融合分子的功能性組分/結(jié)構(gòu)域可選自能夠影響基因轉(zhuǎn)錄的多種不同組分中的任何一種，只要融合分子經(jīng)由其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶序列。因此，功能性組分可包括，但不限于，各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域，例如激活物、阻遏物、共激活物、共阻遏物和沉默子。

在某些實施方案中，融合蛋白包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核酸酶結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生能夠通過它們的工程化的(ZFP或TALE)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域來識別它們的預(yù)期核酸靶的功能實體，和產(chǎn)生核酸酶(例如，鋅指核酸酶或TALE核酸酶)，以導(dǎo)致DNA經(jīng)由核酸酶活性在DNA結(jié)合位點附近被裂解。

因此，本文所述的方法和組合物具有廣泛適用性，并且可以涉及任何目標核酸酶。核酸酶的非限制性實例包括大范圍核酸酶、TALEN和鋅指核酸酶。核酸酶可包含異源DNA結(jié)合和裂解結(jié)構(gòu)域(例如，鋅指核酸酶；TALEN；具有異源裂解結(jié)構(gòu)域的大范圍核酸酶DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或，可選擇地，可改變天然存在的核酸酶的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以結(jié)合選擇的靶位點(例如，已被工程化來結(jié)合不同于同源結(jié)合位點的位點的大范圍核酸酶)。

核酸酶結(jié)構(gòu)域可以源自任何核酸酶，例如任何內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶。可以與本文所述的Htt DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的合適的核酸酶(裂解)結(jié)構(gòu)域的非限制性實例包括來自任何限制性內(nèi)切酶的結(jié)構(gòu)域，例如IIS型限制性內(nèi)切酶(例如，F(xiàn)okI)。在某些實施方案中，裂解結(jié)構(gòu)域是需要二聚化來具有裂解活性的裂解半結(jié)構(gòu)域。見，例如，美國專利第8,586,526號；第8,409,861號和第7,888,121號，將其通過引用整體并入本文。通常地，如果融合蛋白包含裂解半結(jié)構(gòu)域，則需要兩個融合蛋白用于裂解?；蛘撸墒褂冒瑑蓚€裂解半結(jié)構(gòu)域的單一蛋白質(zhì)。兩個裂解半結(jié)構(gòu)域可以源自相同的內(nèi)切核酸酶(或其功能性片段)，或每個裂解半結(jié)構(gòu)域可源自不同的內(nèi)切核酸酶(或其功能性片段)。另外，優(yōu)選地將兩個融合蛋白的靶位點彼此相對地設(shè)置，以使得兩個融合蛋白與其各自的靶位點的結(jié)合將裂解半結(jié)構(gòu)域置于彼此的空間取向，這使得裂解半結(jié)構(gòu)域例如通過二聚化形成功能性裂解結(jié)構(gòu)域。

核酸酶結(jié)構(gòu)域還可以源自具有裂解活性的任何大范圍核酸酶(歸巢內(nèi)切核酸酶)結(jié)構(gòu)域，也可與本文所述的核酸酶一起使用，所述核酸酶包括但不限于I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。

在某些實施方案中，核酸酶包含致密TALEN(cTALEN)。這些酶是將TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接于TevI核酸酶結(jié)構(gòu)域的單鏈融合蛋白。取決于TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對于大范圍核酸酶(例如，TevI)核酸酶結(jié)構(gòu)域所處的位置，融合蛋白可用作由TALE區(qū)定位的切口酶，或者可以產(chǎn)生雙鏈斷裂(見，Beurdeley等(2013)Nat Comm:1-8DOI:10.1038/ncomms2782)。

在其它實施方案中，TALE-核酸酶是大TAL。這些大TAL核酸酶是包含TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和大范圍核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。大范圍核酸酶裂解結(jié)構(gòu)域作為單體是有活性的并且不需要二聚化來具有活性。(見Boissel等，(2013)Nucl Acid Res:1-13,doi:10.1093/nar/gkt1224)。

另外，大范圍核酸酶的核酸酶結(jié)構(gòu)域還可表現(xiàn)出DNA結(jié)合功能。任何TALEN可以與另外的TALEN(例如，一種或多種TALEN(cTALEN或FokI-TALEN)與一種或多個種TAL)和/或ZFN組合使用。

另外，相較于野生型，裂解結(jié)構(gòu)域可包括一個或多個改變，例如用于形成減少或消除脫靶裂解效應(yīng)的專性異源二聚體。參，見例，如美國專利第7,914,796號；第8,034,598號和第8,623,618號，通過引用整體并入本文。

如本文所述的核酸酶可在雙鏈靶(例如，基因)中產(chǎn)生雙鏈或單鏈斷裂。單鏈斷裂(“缺口”)的產(chǎn)生描述于例如美國專利第8,703,489號(通過引用并入本文)中，該專利描述了核酸酶結(jié)構(gòu)域之一的的催化結(jié)構(gòu)域的突變?nèi)绾螌?dǎo)致切口酶。

因此，核酸酶(裂解)結(jié)構(gòu)域或裂解半結(jié)構(gòu)域可以是保留裂解活性或保留多聚化(例如，二聚化)以形成功能性裂解結(jié)構(gòu)域的能力的蛋白質(zhì)的任何部分。

或者，可使用所謂的“裂解酶”技術(shù)(見，例如，美國專利公開第20090068164號)在核酸靶位點上體內(nèi)組裝核酸酶。此類裂解酶的組分可在單獨的表達構(gòu)建體上表達，或可被連接在其中單個組分例如通過自裂解2A肽或IRES序列分開的一個開放閱讀框架中。組分可以是單個鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域或大范圍核酸酶核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。

可在使用之前例如在美國公開第20090111119號中描述的基于酵母的染色體系統(tǒng)中篩選核酸酶的活性?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法容易地設(shè)計核酸酶表達構(gòu)建體。

融合蛋白的表達可在組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子(例如在棉子糖和/或半乳糖存在的情況下被激活(去阻遏)并且在葡萄糖存在的情況下被抑制的半乳糖激酶啟動子)的控制下。在某些實施方案中，啟動子自我調(diào)節(jié)融合蛋白的表達，例如經(jīng)由包含高親和力結(jié)合位點。見，例如于2014年3月18日提交的美國申請第61,955,002號。

遞送

可通過任何合適的方法將蛋白質(zhì)和/或多核苷酸(例如，ZFP、TALE、CRISPR/Cas)和包含本文所述的蛋白質(zhì)和/或多核苷酸的組合物遞送至靶細胞，所述方法包括，例如，通過注射蛋白質(zhì)，經(jīng)由mRNA和/或使用表達構(gòu)建體(例如，質(zhì)粒、慢病毒載體、AAV載體、Ad載體等)。

例如，在美國專利第6,453,242號；第6,503,717號；第6,534,261號；第6,599,692號；第6,607,882號；第6,689,558號；第6,824,978號；第6,933,113號；第6,979,539號；第7,013,219號和第7,163,824號(所有這些專利的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)中描述了遞送包含本文所述的鋅指蛋白的蛋白質(zhì)的方法。

可以使用任何載體系統(tǒng)，包括但不限于質(zhì)粒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體和相關(guān)病毒載體等。也見，美國專利第8,586,526號；第6,534,261號；第6,607,882號；第6,824,978號；第6,933,113號；第6,979,539號；第7,013,219號和第7,163,824號(通過引用整體并入本文)。此外，顯而易見的是，任何這些載體可包含一個或多個DNA結(jié)合蛋白編碼序列。因此，當將一個或多個ZFP、TALE或CRISPR/Cas蛋白引入細胞時，可將編碼ZFP、TALE或CRISPR/Cas蛋白的序列攜帶在相同載體上或不同載體上。當使用多個載體時，每個載體可包含編碼一個或多個ZFP、TALE或CRISPR/Cas系統(tǒng)的序列。

可使用常規(guī)的基于病毒和非病毒的基因轉(zhuǎn)移方法來在細胞(例如，哺乳動物細胞)和靶組織中引入編碼工程化的ZFP、TALE或CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸。此類方法也可用于在體外向細胞施用編碼ZFP、TALE或CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸。在某些實施方案中，對于體內(nèi)或離體基因療法用途，施用編碼ZFP、TALE或CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸。非病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、裸核酸和與遞送載體(諸如脂質(zhì)體或泊洛沙姆)復(fù)合的核酸。病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，其在遞送至細胞后具有附加型或被整合的基因組。關(guān)于基因療法的綜述，見Anderson,Science 256:808-813(1992)；Nabel&Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani&Caskey,TIBTECH11:162-166(1993)；Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature357:455-460(1992)；Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995)；Kremer&Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995)；Haddada等，于Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and(編輯)(1995)；和Yu等，Gene Therapy 1:13-26(1994)。

核酸的非病毒遞送的方法包括電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、顯微注射、基因槍、病毒體、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂質(zhì):核酸綴合物、裸DNA、裸RNA、人工病毒體和試劑增強的DNA攝取。使用例如Sonitron 2000系統(tǒng)(Rich-Mar)的聲致穿孔也可用于遞送核酸。在優(yōu)選的實施方案中，可將一種或多種核酸作為mRNA遞送。還優(yōu)選的是使用加帽的mRNA來增加翻譯效率和/或mRNA穩(wěn)定性。特別優(yōu)選的是ARCA(抗反轉(zhuǎn)帽類似物)帽或其變體。見，美國專利US7074596和US8153773，通過引用并入本文。

另外的示例性核酸遞送系統(tǒng)包括由Amaxa Biosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics Inc提供的那些遞送系統(tǒng)(見例如US6008336)。在例如美國專利第5,049,386號；第4,946,787號和第4,897,355號中描述脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑是商購可得的(例如，Transfectam^TM和Lipofectin^TM，以及Lipofectamine^TM RNAiMAX)。適合用于多核苷酸的高效受體-識別脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的陽離子和中性脂質(zhì)包括Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些脂質(zhì)。遞送可以是至細胞(離體施用)或靶組織(體內(nèi)施用)。

脂質(zhì):核酸復(fù)合物(包括靶向脂質(zhì)體，諸如免疫脂質(zhì)復(fù)合物)的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(見，例如，Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等，Cancer Gene Ther.2:291-297(1995)；Behr等，Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等，Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等，Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等，Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美國專利第4,186,183號、第4,217,344號、第4,235,871號、第4,261,975號、第4,485,054號、第4,501,728號、第4,774,085號、第4,837,028號和第4,946,787號)。

另外的遞送方法包括使用包裝待遞送到EnGeneIC遞送載體(EDV)中的核酸。使用雙特異性抗體(其中抗體的一條臂具有針對靶組織的特異性，并且另一條臂具有針對EDV的特異性)將這些EDV特異性遞送到靶組織。所述抗體將EDV帶至靶細胞表面，隨后EDV通過胞吞作用被帶入細胞。一旦進入細胞，釋放內(nèi)容物(見，MacDiarmid等(2009)Nature Biotechnology 27(7):643)。

基于RNA或DNA病毒的系統(tǒng)用于遞送編碼工程化ZFP、TALE或CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸的用途利用了高度進化的方法，來將病毒靶向體內(nèi)特定細胞并將病毒有效載荷運輸至核。病毒載體可被直接施用于患者(體內(nèi))，或者它們可被用于體外處理細胞，并且將經(jīng)修飾的細胞施用于患者(離體)。用于遞送ZFP、TALE或CRISPR/Cas的常規(guī)的基于病毒的系統(tǒng)包括，但不限于，用于基因轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、牛痘載體和單純皰疹病毒載體?？赡苡媚孓D(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒基因轉(zhuǎn)移法進行宿主基因組中的整合，這通常導(dǎo)致插入的轉(zhuǎn)基因的長期表達。另外，已在許多不同的細胞類型和靶組織中觀察到高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

逆轉(zhuǎn)錄病毒的向性可以通過摻入外源包膜蛋白，擴展靶細胞的潛在靶群體來改變。慢病毒載體是能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染非分裂細胞并通常產(chǎn)生高病毒滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的選擇取決于靶組織。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體由順式作用的長末端重復(fù)序列組成，具有高達6-10kb外源序列的包裝能力。最小的順式作用LTR足以復(fù)制和包裝載體，所述載體隨后被用于將治療基因整合至靶細胞中以提供永久轉(zhuǎn)基因表達。廣泛使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括基于小鼠白血病病毒(MuLV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)及其組合的那些載體(見，例如，Buchscher等，J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等，J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfelt等，Virol.176:58-59(1990)；Wilson等，J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等，J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。

在其中優(yōu)選瞬時表達的應(yīng)用中，可使用基于腺病毒的系統(tǒng)?；谙俨《镜妮d體在許多細胞類型中能夠具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，并且不需要細胞分裂。通過使用這樣的載體，已經(jīng)獲得了高滴度和高水平的表達。該載體可在相對簡單的系統(tǒng)中大量產(chǎn)生。腺相關(guān)病毒(“AAV”)載體也用于轉(zhuǎn)導(dǎo)具有靶核酸的細胞，例如在體外產(chǎn)生核酸和肽，以及用于體內(nèi)和離體基因治療方法(見，例如，West等，Virology 160:38-47(1987)；美國專利第4,797,368號；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)。重組AAV載體的構(gòu)建描述于許多出版物中，包括美國專利第5,173,414號；Tratschin等，Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等，Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka,PNAS81:6466-6470(1984)；和Samulski等，J.Virol.63:03822-3828(1989)中。

至少6種病毒載體方法目前可用于臨床試驗中的基因轉(zhuǎn)移，所述病毒載體法利用涉及利用插入輔助細胞系以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的的基因互補缺陷型載體的方法。

pLASN和MFG-S是已經(jīng)用于臨床試驗的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實例(Dunbar等，Blood 85:3048-305(1995)；Kohn等，Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等，PNAS 94:22 12133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因療法試驗的第一種治療載體。(Blaese等，Science 270:475-480(1995))。對于MFG-S包裝載體已經(jīng)觀察到50％或更大的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。(Ellem等，Immunol Immunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等，Hum.Gene Ther.1:111-2(1997).

重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)是基于有缺陷的和非致病性細小病毒腺相關(guān)2型病毒的有希望的替代基因遞送系統(tǒng)。所有載體源自僅保留側(cè)連轉(zhuǎn)基因表達盒的AAV 145bp反向末端重復(fù)序列的質(zhì)粒。因整合至轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞的基因組中而產(chǎn)生的高效基因轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因遞送是該載體系統(tǒng)的關(guān)鍵特征(Wagner等，Lancet 351:9117 1702-3(1998),Kearns等，Gene Ther.9:748-55(1996))。其它AAV血清型，包括AAV1，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV8AAV 8.2，AAV9，以及AAV rh10和假型化的AAV諸如AAV2/8，AAV2/5和AAV2/6也可以根據(jù)本發(fā)明使用。

復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(Ad)可以以高滴度產(chǎn)生并且容易感染許多不同的細胞類型。對大多數(shù)腺病毒載體進行工程化，以使得轉(zhuǎn)基因替代Ad E1a、E1b和/或E3基因；隨后，在反式提供缺失的基因功能的人293細胞中繁殖復(fù)制缺陷型載體。Ad載體可在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)多種類型的組織，包括非分裂的分化細胞，諸如在肝、腎和肌肉中發(fā)現(xiàn)的那些細胞。常規(guī)Ad載體具有大的載量。在臨床試驗中使用Ad載體的實例包括用于利用肌內(nèi)注射的抗腫瘤免疫的多核苷酸療法(Sterman等，Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。腺病毒載體用于臨床試驗中的基因轉(zhuǎn)移的用途的另外的實例包括Rosenecker等，Infection24:1 5-10(1996)；Sterman等，Hum.Gene Ther.9:7 1083-1089(1998)；Welsh等，Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)；Alvarez等，Hum.Gene Ther.5:597-613(1997)；Topf等，Gene Ther.5:507-513(1998)；Sterman等，Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)。

包裝細胞用于形成能夠感染宿主細胞的病毒顆粒。此類細胞包括包裝腺病毒的293細胞和包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒的Ψ2細胞或PA317細胞。用于基因療法的病毒載體通常由將核酸載體包裝至病毒顆粒中的生產(chǎn)者細胞系產(chǎn)生。載體通常含有包裝和隨后整合入宿主(如果適用)所需的最小病毒序列，其它病毒序列被編碼待表達的蛋白質(zhì)的表達盒替代。缺少的病毒功能由包裝細胞系反式提供。例如，用于基因療法的AAV載體通常僅具有來自AAV基因組的反向末端重復(fù)(ITR)序列，其是包裝和整合入宿主基因組所需的。病毒DNA被包裝在細胞系中，所述細胞含有編碼另外的AAV基因(即rep和cap，但缺少ITR序列)的輔助質(zhì)粒。所述細胞系也用腺病毒(作為輔助病毒)感染。輔助病毒促進AAV載體的復(fù)制和來自輔助質(zhì)粒的AAV基因的表達。由于缺乏ITR序列，輔助質(zhì)粒不以顯著的量被包裝?？赏ㄟ^例如腺病毒比AAV更敏感的熱處理來減少腺病毒的污染。

在許多基因療法應(yīng)用中，期望將基因療法載體以高度特異性遞送至特定組織類型。因此，可通過將配體作為與病毒外殼蛋白的融合蛋白在病毒外表面上表達來修飾病毒載體以具有對給定細胞類型的特異性。選擇配體以對已知存在于目標細胞類型上的受體具有親和力。例如，Han等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)報道了可以修飾莫洛尼小鼠白血病病毒以表達與gp70融合的人調(diào)蛋白(heregulin)，以及重組病毒感染某些表達人表皮生長因子受體的人乳腺癌細胞。該原理可以擴展到其它病毒-靶細胞對，其中所述靶細胞表達所述受體，并且所述病毒表達包含所述細胞表面受體的配體的融合蛋白。例如，絲狀噬菌體可以被工程化來顯示對幾乎任何選擇的細胞受體具有特異性結(jié)合親和力的抗體片段(例如，F(xiàn)AB或Fv)。盡管上述描述主要應(yīng)用于病毒載體，但相同的原理可應(yīng)用于非病毒載體。此載體可被工程化以包含有利于特定靶細胞攝取的特異性攝取序列。

如下所述，基因療法載體可通過向個體患者施用，通常通過全身性施用(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或顱內(nèi)輸注)或局部應(yīng)用來在體內(nèi)遞送?；蛘撸蓪⑤d體離體遞送至細胞，例如從個體患者移出的細胞(例如，淋巴細胞、骨髓抽出物、組織活檢)或通用供體造血干細胞，隨后將細胞重新植入患者體內(nèi)，通常在選擇已經(jīng)摻入載體的細胞之后。

在某些實施方案中，在體內(nèi)直接遞送本文所述的組合物(例如，多核苷酸和/或蛋白質(zhì))。可將組合物(細胞、多核苷酸和/或蛋白質(zhì))直接施用至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，包括但不限于直接注射至腦或脊髓中。可靶向腦的一個或多個區(qū)域，包括但不限于海馬、黑質(zhì)、Meynert基底核(NBM)、紋狀體和/或皮層?？蛇x擇地或除了CNS遞送之外，可全身性施用(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、心內(nèi)、肌內(nèi)、硬膜內(nèi)、皮下和/或顱內(nèi)輸注)所述組合物。用于將本文所述的組合物直接遞送至受試者(包括直接進入CNS)的方法和組合物包括但不限于經(jīng)由針組件的直接注射(例如，立體定向注射)。此類方法描述于例如美國專利第7,837,668號、第8,092,429號(其涉及將組合物(包括表達載體)遞送至腦)和美國專利公開號20060239966(容通過引用整體并入本文)中。

用于診斷、研究或或用于基因療法的離體細胞轉(zhuǎn)染(例如，經(jīng)由將轉(zhuǎn)染的細胞重新輸注至宿主生物體中)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在優(yōu)選實施方案中，從受試生物分離細胞，用ZFP、TALE或CRISPR/Cas系統(tǒng)核酸(基因、cDNA或mRNA)轉(zhuǎn)染，并重新輸注回所述受試生物體(例如，患者)。在優(yōu)選的實施方案中，將一種或多種核酸作為mRNA遞送。還優(yōu)選的是使用加帽的mRNA以增加翻譯效率和/或mRNA穩(wěn)定性。特別優(yōu)選的是ARCA(抗反轉(zhuǎn)帽類似物)帽或其變體。見美國專利7,074,596和8,153,773(通過引用整體并入本文)。適于離體轉(zhuǎn)染的各種細胞類型是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(見，例如Freshney等，Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique(第3版1994)和其中引用來討論如何從患者中分離和培養(yǎng)細胞的參考文獻)。

在一個實施方案中，將干細胞用于細胞轉(zhuǎn)染和基因療法的離體方法。使用干細胞的有利方面是它們可在體外分化為其它細胞類型，或者可被引入哺乳動物(諸如細胞的供體)中，在所述動物中它們將移入骨髓。使用細胞因子諸如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α將CD34+細胞體外分化成臨床上重要的免疫細胞類型的方法是已知的(見Inaba等，J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。

使用已知方法分離干細胞以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化。例如，通過用結(jié)合不想要的細胞諸如CD4+和CD8+(T細胞)、CD45+(panB細胞)、GR-1(粒細胞)和Iad(分化的抗原呈遞細胞)的抗體淘選骨髓細胞，從骨髓細胞分離干細胞(參見Inaba等，J.Exp.Med.176:1693-1702(1992))。

已被修飾的干細胞也可以用于一些實施方案中。例如，已被制備來對細胞凋亡具有抗性的神經(jīng)元干細胞可以用作治療組合物，其中干細胞還含有本發(fā)明的ZFP TF。例如，通過在干細胞，或在半胱天冬酶中破壞的那些干細胞中使用BAX或BAK特異性TALEN或ZFN(見美國專利第8,597,912號)，或例如再使用半胱天冬酶-6特異性ZFN，來敲除BAX和/或BAK，可產(chǎn)生對細胞凋亡的抗性。這些細胞可以用已知調(diào)節(jié)突變型或野生型Htt的ZFP TF或TALE TF轉(zhuǎn)染。

還可將含有治療性ZFP核酸的載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等)直接施用至生物體以在體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞?；蛘?，可以施用裸DNA。施用通常用于將分子引入與血液或組織細胞最終接觸的任何途徑，包括但不限于注射、輸注、局部應(yīng)用和電穿孔。施用此類核酸的合適方法是可獲得的并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且盡管可使用多于一種途徑來施用特定組合物，但特定途徑通?？商峁┍攘硪煌緩礁苯雍透行У姆磻?yīng)。

用于將DNA引入造血干細胞的方法公開于例如美國專利第5,928,638號。可用于將轉(zhuǎn)基因引入造血干細胞例如CD34⁺細胞的載體包括35型腺病毒。

適于將轉(zhuǎn)基因?qū)朊庖呒毎?例如，T細胞)的載體包括非整合型慢病毒載體。見，例如，Ory等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388；Dull等(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zuffery等(1998)J.Virol.72:9873-9880；Follenzi等(2000)Nature Genetics25:217-222。

藥學(xué)上可接受的載體部分地由待施用的特定組合物以及由用于施用組合物的特定方法來確定。因此，存在多種可用的藥物組合物的合適制劑，如下所述的(見，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，1989)。

如上所述，所公開的方法和組合物可用于任何類型的細胞，包括但不限于原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞和人細胞。用于蛋白質(zhì)表達的合適的細胞系是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括但不限于COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、perC6、昆蟲細胞例如草地貪夜蛾(Sf)，和真菌細胞諸如酵母屬、Pischia和裂殖酵母屬。還可使用這些細胞系的后代、變體和衍生物。

待施用的有效量將因患者和根據(jù)施用方式和施用部位而異。因此，有效量最好由施用組合物的醫(yī)生決定，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定適當?shù)膭┝?。在允許足夠的時間用于整合和表達(例如，通常為4-15天)后，分析治療性多肽的血清或其它組織水平并與施用前的初始水平進行比較可確定施用的量是否太低，在正確的范圍內(nèi)還是太高。初次和后續(xù)施用的合適方案也是可變的，但是如果必要，其代表為初始施用，隨后給予后續(xù)施用。后續(xù)施用可以以可變的間隔施用，范圍從每日1次至每年1次至每幾年1次。在某些實施方案中，

為了使用腺相關(guān)病毒(AAV)載體將ZFP直接遞送至人腦，可以應(yīng)用每個紋狀體1x10¹⁰-5x10¹²(或其間的任何值)個載體基因組的劑量范圍。如上所述，對于其它腦結(jié)構(gòu)和對于不同的遞送方案，劑量可以變化。

應(yīng)用

如本文所述的Htt結(jié)合分子(例如，ZFP、TALE、CRISPR/Cas系統(tǒng)，Ttago等)和編碼它們的核酸可用于多種應(yīng)用。這些應(yīng)用包括其中將Htt結(jié)合分子(包括編碼DNA結(jié)合蛋白的核酸)施用于受試者并用于調(diào)節(jié)受試者內(nèi)靶基因表達的治療方法。調(diào)節(jié)可以是抑制，例如，對引起HD疾病狀態(tài)的mHtt的抑制的形式。或者，當表達的激活或內(nèi)源性細胞基因的增加的表達可改善疾病狀態(tài)時，調(diào)節(jié)可以是激活的形式。在另外的實施方案中，調(diào)節(jié)可以是裂解(例如，通過一種或多種核酸酶)，例如，用于使突變型Htt基因失活。如上所述，對于此類應(yīng)用，將Htt-結(jié)合分子或更典型地編碼它們的核酸與藥學(xué)上可接受的載體一起配制為藥物組合物。

可將單獨的或與其它合適組分(例如脂質(zhì)體、納米顆?；虮绢I(lǐng)域已知的其它組分)組合的Htt-結(jié)合分子或編碼它們的載體制成氣溶膠制劑(即，它們可被“霧化”)經(jīng)由吸入施用。可將氣溶膠制劑置于加壓的可接受的推進劑諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等中。適于胃腸外施用(諸如，例如，通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)和皮下途徑)的制劑包括水性和非水性等滲無菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與預(yù)期接受者的血液等滲的溶質(zhì)，以及水性和非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。組合物可以例如通過靜脈內(nèi)輸注、口服、局部、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)或鞘內(nèi)施用?；衔锏闹苿┛梢砸詥挝粍┝炕蚨鄠€劑量存在于密封容器，例如安瓿和小瓶中。注射溶液和懸浮液可從前述類型的無菌粉末、顆粒和片劑制備。

向患者施用的劑量應(yīng)足以在患者中隨時間推移產(chǎn)生有益的治療反應(yīng)。劑量由所用的特定Htt結(jié)合分子的功效和K_d、靶細胞和患者的狀況以及待治療患者的體重或表面積確定。劑量的大小還由伴隨特定患者的特定化合物或載體的施用的任何不良副作用的存在、性質(zhì)和程度來確定。

在其它應(yīng)用中，使用被設(shè)計來測量患者中(例如樣品例如腦脊液(CSF)中)mHTT蛋白的量的檢測方法分析本文所述分子的功效。例如，如Wild等(2014)J.Neurol Neurosurg Psychiatry 85:10中描述的超敏感免疫測定可用于檢測(和/或定量)患者樣品中與HD相關(guān)的突變型Htt蛋白的存在。在某些實施方案中，CSF中mHtt水平的變化的檢測提供了用于響應(yīng)于如本文所述的HD療法(例如，ZFP、TALE等)確定受試者中HD的進展的診斷。

可以使用用于進行診斷測定的任何合適的形式，包括免疫測定。例如，可將捕獲試劑(例如抗體，受體等)固定在ELISA板上?；蛘?，檢測試劑與芯片上的超敏感免疫檢測一起使用，以通過本領(lǐng)域已知的方法諸如磁性粒子掃描進行定量(參見例如Cornaglia等(2014)Anal Chem 86(16):8213-23)。在其中可發(fā)生結(jié)合的條件下將檢測試劑與懷疑含有突變型Htt蛋白的樣品接觸，并通過本領(lǐng)域已知的方法進行定量。

因此，由于mHTT水平與疾病負荷評分和濃度隨疾病進展的水平升高相關(guān)，因此在CSF或其它患者樣品中檢測mHtt允許監(jiān)測HD中Htt-結(jié)合分子治療的功效以及幫助研究治療對HD的神經(jīng)病理生物學(xué)的影響，并且可用于支持如本文所述的疾病改善性HD療法的臨床試驗。

以下實施例涉及本公開的示例性實施方案，其中Htt-調(diào)節(jié)劑包含鋅指蛋白或CRISPR/Cas系統(tǒng)。應(yīng)當理解的是，這僅僅是為了舉例說明的目的，并且可以使用其它Htt調(diào)節(jié)劑，包括但不限于TALE-TF、另外的ZFP、ZFN、TALEN、另外的CRISPR/Cas系統(tǒng)、具有工程化DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的歸巢內(nèi)切核酸酶(大范圍核酸酶)。

實施例

實施例1：ZFP-TF拯救培養(yǎng)的HD神經(jīng)元的表型

各種研究已顯示與HD患者來源的細胞中擴增的CAG重復(fù)相關(guān)的表型改變，諸如細胞內(nèi)ATP水平降低和對生長因子撤除的易損性增加。見，例如，Jung-Il等(2012)Biochemical Journal 446(3):359-371；HD IPSC Consortium(2012)Cell Stem Cell 11(2):264-278；An等(2012)Cell Stem Cell 11(2):253-263。

因此，我們評估了Htt的等位基因特異性ZFP阻遏物的表達是否在患者來源的神經(jīng)元中拯救這樣的表型。簡言之，如本文和美國專利公開第20130253040號中所述，產(chǎn)生用于Venus(GFP)和ZFP-TF33074-KOX-2A-Venus的慢病毒載體?？闪呀獾?A肽允許Venus(GFP)和ZFP從同一載體表達，并且可以通過GFP表達鑒定ZFP表達細胞。慢病毒表達構(gòu)建體是第三代自失活的基于HIV的LV。通過在CMV啟動子下游插入具有2A接頭和GFP Venus的ZFP-TF來構(gòu)建33074表達載體。GFP表達構(gòu)建體僅含有CMV啟動子下游的GFP-Venus。通過使用lipofectamine 2000(Life Technologies)瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞來制備重組LV。轉(zhuǎn)染后48和72小時收獲病毒上清液，通過0.45μm過濾器過濾，然后通過在4℃下以50,000×g超速離心(Optima L-80K制備超速離心機，Beckman Coulter)90分鐘來濃縮300倍。然后將病毒沉淀重懸浮于Hank緩沖鹽溶液(Lonza)中并在-80C下儲存。通過293T細胞的感染測定病毒滴度，并通過GFP-VENUS表達的流式細胞術(shù)分析來測量。

利用accutase進行HD-ESC傳代，并將其在E8培養(yǎng)基(Life Technologies)中培養(yǎng)在基質(zhì)膠包被的平板上。使用StemPro神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Life Technologies)衍生神經(jīng)干細胞。簡言之，將ESC以200,000個細胞/孔接種于geltrex涂覆的6孔皿，當10-20％匯合時，將培養(yǎng)基更換為StemPro神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每2天更換培養(yǎng)基，并在第7天收獲和擴增NSC。使用StemPro NSC SFM培養(yǎng)基(Life Technologies)培養(yǎng)HD-NSC和非HD NSC(HIP^TMGlobalstem)。NSC在geltrex包被的板上用accutase傳代。通過將培養(yǎng)基變成神經(jīng)分化培養(yǎng)基來誘導(dǎo)神經(jīng)元分化，所述神經(jīng)分化培養(yǎng)基含有具有B-27無血清補充劑和GlutaMAX^TM(Life Technologies)的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。每3-4天更換一次培養(yǎng)基。

使用用于Venus(GFP)和ZFP-TF 33074-KOX-2A-Venus的慢病毒載體以500的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)分化的神經(jīng)元。隨后，用新鮮的神經(jīng)分化培養(yǎng)基替換上清液，并將培養(yǎng)物維持長達21天。

使用CellTiter-發(fā)光測定(Promega)測量源自HD患者(CAG17/48)或正常受試者的培養(yǎng)的神經(jīng)元的細胞內(nèi)ATP水平，使用ApoLive-測定(Promega)測定每一個樣品中的細胞數(shù)量。簡言之，根據(jù)制造商的說明書，使用CellTiter-Glo發(fā)光測定(Promega)測量神經(jīng)元中的細胞內(nèi)ATP水平。30分鐘后在Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2微孔板讀數(shù)器上測量發(fā)光(RLU)，并且通過使用ApoLive-Glo測定(Promega)和測量熒光(A.U.)將值針對孔中的細胞數(shù)進行標準化。然后將來自不同細胞/處理的每孔ATP水平的值針對模擬感染的HD神經(jīng)元的值進行標準化。

如圖1所示，模擬感染的或Lenti-GFP感染的HD神經(jīng)元已顯著降低了相對于非HD(正常)神經(jīng)元的ATP的細胞內(nèi)水平。相反地，Lenti-33074-KOX-2A-GFP感染導(dǎo)致HD神經(jīng)元中細胞內(nèi)ATP水平增加約60％，表明ZFP驅(qū)動的突變型Htt等位基因的抑制使這些細胞的能量代謝受損。

使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標記(TUNEL)測定法測量由生長因子撤除誘導(dǎo)的HD和非HD神經(jīng)元的細胞死亡。簡言之，如上文對于ATP測定所述，用LV一式三份感染神經(jīng)元。將細胞培養(yǎng)12天，然后將培養(yǎng)基更換為無任何添加劑(生長因子)的新鮮神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將細胞保持在該生長因子撤除培養(yǎng)基中48小時。使用ApoBrdU Red DNA fragmentation試劑盒(BioVision)進行TUNEL測定。在冰上用4％多聚甲醛固定神經(jīng)元15分鐘。根據(jù)制造商的推薦(ApoBrdU Red DNA fragmentation試劑盒，BioVision)通過定量TUNEL陽性細胞來評估細胞凋亡。將流式細胞計量術(shù)用于測量細胞凋亡(通過抗BrdU-Red染色)和LV轉(zhuǎn)導(dǎo)(通過GFP)。

如圖2所示，在48小時的生長因子撤除后，HD神經(jīng)元(模擬感染的)顯示出比非HD神經(jīng)元(約20％)高的細胞死亡率(約50％)。雖然Lenti-GFP感染不影響HD神經(jīng)元中的細胞死亡水平，但Lenti-33074-KOX-2A-GFP感染導(dǎo)致以凋亡細胞百分比表示的顯著的神經(jīng)元減少(從約50％至20％)。

因此，突變型Htt的ZFP驅(qū)動的抑制降低了HD神經(jīng)元對生長因子撤除的易損性。

實施例2：ZFP-TF防止和逆轉(zhuǎn)Q175小鼠中的突變型Htt聚集

在Q175敲入小鼠模型(Menalled等(2012)PLoS One7(12):e49838)中測試了突變型Htt ZFP-TF(ZFP-30640和30645)的等位基因特異性阻遏物的體內(nèi)功效，在所述小鼠模型中小鼠Htt等位基因之一的外顯子1被含有擴增的CAG重復(fù)(約179CAG)的人Htt外顯子1序列替代。突變型Htt的病理聚集可開始在2月齡的Q175小鼠的紋狀體中被檢測到，并且隨著年齡而繼續(xù)增加；到6月齡時，聚集被良好地建立。

為了測試ZFP是否可防止突變型Htt在紋狀體中的積累，對2月齡Q175小鼠進行AAV-ZFP或AAV-GFP(作為陰性對照)的單側(cè)紋狀體內(nèi)注射(2x10¹⁰個載體基因組/紋狀體)；ZFP和GFP表達由人突觸蛋白1啟動子驅(qū)動。

注射后2個月(4月齡)，收獲腦，切片并進行免疫組織化學(xué)分析以評估ZFP和Htt表達。通過針對FLAG表位標簽的抗體檢測ZFP表達，并通過抗Htt抗體(mEM48)檢測突變型Htt聚集。來自注射AAV-30645的小鼠的代表性圖像顯示于圖3A至3H中。在沒有接受注射的對側(cè)紋狀體中，容易檢測到突變型Htt(mEM48)聚集；在接受AAV-30645注射的同側(cè)紋狀體中，在ZFP表達細胞中僅觀察到非常低水平的突變型Htt聚集(由陽性FLAG染色指示的)。

如圖3I所示，當分別對AAV-ZFP和AAV-GFP注射的小鼠的同側(cè)紋狀體中的FLAG(+)和GFP(+)細胞定量每細胞的核Htt聚集物的數(shù)量，并隨后針對未注射的對側(cè)紋狀體中每個細胞的聚集物數(shù)目進行標準化時，ZFP-30640和30645都顯著減少(>90％)核Htt聚集物的數(shù)目(P<0.001，Kruskal Wallis檢驗和Dunn多重比較)。

如圖3J所示，當將表達ZFP或GFP的細胞中的核mEM48染色的強度針對來自對側(cè)紋狀體的神經(jīng)元中的所述染色強度進行標準化時，在注射ZFP的紋狀體中觀察到核mEM48強度降低50-60％(P<0.001)。如圖3K中所示，將ZFP-或GFP表達細胞中核周突變型Htt聚集物的密度針對對側(cè)紋狀體神經(jīng)元中的所述密度進行標準化，在注射ZFP的紋狀體中觀察到核周Htt聚集物密度降低45-70％(P<0.01)。

這些結(jié)果顯示，當在2月齡時注射時，ZFP-TF在4月齡時防止Q175小鼠紋狀體中的突變型Htt聚集。

為了測試ZFP是否可逆轉(zhuǎn)良好建立的Htt聚集，對6月齡Q175小鼠進行AAV-GFP-2A-ZFP的單側(cè)紋狀體內(nèi)注射；可裂解的2A肽允許GFP和ZFP從同一載體表達，并且可通過GFP表達鑒定ZFP表達細胞。在8月齡時，收獲大腦，切片并進行免疫組織化學(xué)分析以評估Htt聚集。來自AAV-GFP-2A-30645注射的小鼠的代表性圖像顯示于圖4A中。使用針對DARPP-32的抗體(其是紋狀體特異性蛋白)來標記紋狀體。在未接受注射的對側(cè)紋狀體中，觀察到高水平的突變型Htt聚集(通過mEM48抗體檢測的)；在接受AAV-GFP-2A-30645注射的同側(cè)紋狀體中，觀察到突變型Htt聚集的減少。

此外，對AAV-GFP-2A-ZFP和AAV-GFP注射的小鼠的同側(cè)紋狀體中的GFP(+)細胞的每個細胞的核Htt聚集物的數(shù)目進行定量，然后將其針對未注射的對側(cè)紋狀體中每個細胞的聚集物的數(shù)目進行標準化。如圖4B所示，GFP-2A-30640的遞送導(dǎo)致Htt核聚集物數(shù)量減少約20％(P<0.001，Kruskal Wallis檢驗和Dunn多重比較)，GFP-2A-30645的遞送也導(dǎo)致每個細胞的Htt核聚集物的數(shù)量的少量減少。

將來自注射了AAV-GFP-2A-ZFP和AAV-GFP的小鼠的同側(cè)紋狀體的GFP(+)細胞中的核mEM48染色的強度，針對來自對側(cè)紋狀體的神經(jīng)元中的所述染色強度進行標準化。如圖4C所示，在注射GFP-2A-30645的紋狀體中觀察到核mEM48強度降低約20％(P<0.001)。在注射GFP-2A-30640的紋狀體中也觀察到核mEM48強度的約10％的減少。

測量注射AAV-GFP-2A-ZFP-和AAV-GFP的小鼠的同側(cè)紋狀體中的GFP(+)細胞中的核周突變型Htt聚集物的密度，并針對于對側(cè)紋狀體神經(jīng)元中的密度進行標準化。如圖4D所示，在注射ZFP的紋狀體中觀察到核周Htt聚集物密度減小30-50％(P<0.001)。

這些結(jié)果顯示，當在6月齡時注射時，ZFP-TF在僅2個月后在Q175小鼠的紋狀體中逆轉(zhuǎn)先前存在的突變型Htt聚集。如果在分析小鼠腦之前允許ZFP的表達持續(xù)超過2個月，則預(yù)期突變型Htt聚集的更大清除。

總之，數(shù)據(jù)表明，遞送至HD受試者的腦的突變型Htt等位基因阻遏物導(dǎo)致HD神經(jīng)元中細胞內(nèi)ATP濃度的水平升高，HD神經(jīng)元中的細胞凋亡減少，并且防止和清除了現(xiàn)有的Htt聚集物。

實施例3：ZFP-TF處理的功效

對用對突變型Htt等位基因是特異的Htt結(jié)合分子(例如，ZFP-TF、TALE-TF等)處理的受試者進行診斷測試。用本文所述的Htt-結(jié)合分子治療HD受試者。通過標準方法(例如，腰椎穿刺)從受試者抽取CSF，然后將其經(jīng)歷本領(lǐng)域已知的方法以檢測和定量mHtt蛋白(參見Wild等，同上)。在如本文所述的治療后，CSF中的mHtt蛋白水平降低。

實施例4：ZFP-TF防止和減少Q(mào)175小鼠中的突變型Htt聚集，并增加DARPP 32基因的表達

在Q175敲入小鼠模型中測試突變型Htt ZFP-TF(ZFP-33074)的另一等位基因特異性阻遏物的體內(nèi)功效(Menalled等(2012)PLoS One7(12):e49838),，其中小鼠Htt等位基因之一的外顯子1被含有擴增的CAG重復(fù)(約179個CAG)的人Htt外顯子1序列替代。突變型Htt的病理性聚集可開始在2月齡時在Q175小鼠的紋狀體中被檢測到，并且隨年齡繼續(xù)增加；6月齡時聚集被良好地建立。

為了測試ZFP是否可以防止突變型Htt在紋狀體中積累，對2月齡Q175小鼠進行AAV-ZFP-2A-GFP或AAV-GFP(作為陰性對照)的單側(cè)紋狀體內(nèi)注射(2x10¹⁰個載體基因組/紋狀體)；ZFP和GFP表達由人類突觸蛋白1啟動子驅(qū)動。自身可裂解的2A肽允許GFP和ZFP從同一載體表達，并且可通過GFP表達鑒定ZFP表達細胞。

注射后兩個月(4個月齡)，收獲腦，切片并進行免疫組織化學(xué)分析以評估Htt表達。轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞用GFP標記，中間棘神經(jīng)元(MSN)用DARPP32抗體標記，并且通過抗Htt抗體(mEM48)檢測突變型Htt聚集。

如圖5A所示，在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSN(用GFP和DARPP32抗體標記的)中，每個細胞的核Htt聚集物或包涵體的數(shù)目被ZFP 33074顯著減少(P<0.001)。圖5B顯示，在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中核外突變型Htt聚集物的密度在ZFP處理的紋狀體中顯著減少。(P<0.0001)。圖5C顯示在ZFP處理的小鼠中核mEM48染色(突變型Htt)的強度顯著降低(P<0.001)。

這些結(jié)果顯示，當在2月齡時注射時，ZFP 33074防止Q175小鼠的紋狀體中的突變型Htt型聚集。

為了測試ZFP在Htt聚集已在Q175紋狀體中被良好建立后是否可減少所述Htt聚集，對6月齡Q175小鼠進行AAV-GFP-2A-ZFP或AAV-GFP的單側(cè)紋狀體內(nèi)注射。在10個月齡時，收獲大腦，切片并進行免疫組織化學(xué)。

圖6A顯示在AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSN(由GFP和DARPP32抗體標記的)中，每個細胞的核Htt聚集物/包涵體的數(shù)目被ZFP 33074顯著減少(P<0.001)。圖6B顯示，AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中的核外突變型Htt聚集物的密度在ZFP處理的紋狀體中顯著減小。(P<0.0001)。圖6C顯示在ZFP處理的小鼠中核mEM48染色(突變型Htt)的強度顯著降低(P<0.001)。

圖7A顯示在10月齡的Q175小鼠中，相較于年齡匹配的野生型小鼠，MSN標記DARPP32的表達減少(P<0.05)，表明這些小鼠中MSN的消退。圖7B顯示，當Q175小鼠在6月齡時注射AAV-ZFP-2A-GFP并在10月齡時分析DARPP32表達時，相較于對照處理的小鼠，在ZFP 33074處理的小鼠中發(fā)現(xiàn)DARPP32表達顯著增加。

這些結(jié)果一起證明，當在6月齡時注射時，ZFP 33074能夠在現(xiàn)有聚集物存的情況下減少突變型Htt表達和聚集。此外，ZFP 33074能夠拯救DARPP32的表達，表明保護MSN。由于缺少DBD(ZFPΔDBD)的對照載體對突變型Htt聚集或DARPP32表達沒有影響，因此需要將ZFP招募至擴展的CAG重復(fù)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)。

實施例5：CRISPR/Cas-TF防止和減少HD神經(jīng)元中的突變型Htt聚集

用于CRISPR/Cas系統(tǒng)的sgRNA通過本領(lǐng)域已知的方法來合成制備(見Hsu等(2013)Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647或Sternberg等，(2014)Nature 507:62)。如上所述對sgRNA進行工程化，并將其設(shè)計來靶向mHtt中的序列。例如，sgRNA可具有以下序列之一，其中PAM序列加下劃線：

5’GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG3’SEQ ID NO:122

5’GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3’SEQ ID NO:123

5’GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3’SEQ ID NO:124

5’GCAGCAGCAGCAGCAGCAG 3’SEQ ID NO:125

根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法制備CRISPR/Cas轉(zhuǎn)錄因子(見，例如，Perez-Pinera(2013)Nature 10(10):973以及Qi和Arkin(2014)Nature Reviews Microbiology 12:341)。簡言之，使用核酸酶缺陷型Cas9蛋白并將其與抑制結(jié)構(gòu)域(即KRAB)融合。

用編碼Cas9(核酸酶-)-KRAB融合蛋白的mRNA(20μg/mL)和如上所述的sgRNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的HD神經(jīng)元，其中使用BTX ECM830通過電穿孔，經(jīng)由mRNA(例如2-4μg)或DNA表達載體(例如400ng-800ng)引入sgRNA。5天后收集細胞，進行定量Taqman分析以測量mHtt表達。此外，將細胞經(jīng)受上述實驗以測量細胞間ATP水平和分析細胞凋亡。數(shù)據(jù)顯示使用sgRNA的mHtt特異性CRISPR/Cas轉(zhuǎn)錄因子可抑制mHtt的表達并減少由mHtt蛋白聚集引起的表型特征。

實施例6：減少運動缺陷

向動物(例如，小鼠)施用如本文所述的Htt-阻抑物，并定期測試緊握行為，其為這些動物所表現(xiàn)的良好建立的運動缺陷(Mangiarini等1996 Cell 87,493–506)。簡言之，將每只動物從其棲息籠中取出并放置在籠的蓋上。然后動物由觀察者以平滑運動輕輕地向后和向上拉動，直至動物懸掛在表面上方約12英寸。然后對動物評分，進行30秒。如果僅觀察到前肢緊握，則對動物給予1分。如果僅觀察到后肢緊握，則給予動物2分。如果觀察到后肢和前肢緊握，但不同時，則動物被給予3分。由同時的后肢和前肢緊握限定的完全緊握被拉緊進入核心，給予4分。在30秒的懸掛后，將動物返回其棲息籠。對于每個治療組以及年齡匹配的野生型同窩動物，測定在每周觀察時表現(xiàn)出完全緊握(評分為4)的動物的比例。

相較于對照(無Htt-阻遏物)，本文所述的Htt-阻遏物改善了緊握行為(一種良好表征的運動缺陷)。

本文提及的所有專利、專利申請和出版物出于所有目的在此通過引用整體并入。

雖然為了清楚理解的目的通過說明和實例較詳細地提供了公開內(nèi)容，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可實施各種改變和修改。因此，前述描述和實例不應(yīng)被解釋為限制。