專利名稱：一種利用鈷離子金屬螯合親和膜純化木瓜蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白酶的提純領(lǐng)域，特別是涉及一種利用鈷離子金屬螯合親和膜純化木瓜 蛋白酶的方法。
技術(shù)背景木瓜蛋白酶(Papain)簡稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素，酶學(xué)編號(hào)EC3.4.22.2,是利用未成 熟的番木瓜果實(shí)中的乳汁，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)提煉而成的純天然生物酶制品，它是一 類含巰基( SH)蛋白酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，其廣泛的特異性對動(dòng)植物蛋白、多肽、 酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力，能催化各種蛋白質(zhì)，水解成一系列長短不一的短肽或氨基 酸，還能把蛋白水解物合成為類蛋白質(zhì)，由于它的熱穩(wěn)定性好及天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，廣 泛應(yīng)用于食品、皮革、紡織、日化和制藥行業(yè)，提高產(chǎn)品質(zhì)量與檔次，降低成本。目前，木瓜蛋白酶的提取純化主要是采用沉淀法，但是這種方法工藝繁瑣，產(chǎn)品中仍 然混有其它的蛋白酶，純度不高，不能達(dá)到制藥工業(yè)的需求。隨著人們對純度和安全性提 出進(jìn)一步的要求，色譜技術(shù)應(yīng)用于木瓜蛋白酶的純化，如離子交換色譜、親和色譜，該類 填料特異性高，純化倍數(shù)高，但分離速度受粒間擴(kuò)散和低的軸向速率限制，壓降大，分離 時(shí)間長，處理量小，不能使用高的加料速度。而膜分離是一種根據(jù)分子的大小進(jìn)行分離的 技術(shù)，特點(diǎn)是表面積大、擴(kuò)散路徑短、操作壓低、處理量大，但傳統(tǒng)膜分離技術(shù)只有分離 相對分子質(zhì)量相差I(lǐng)O倍以上的物系，不能滿足生化分離的需要。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用鈷離子金屬螯合親和膜提純木瓜蛋白酶 的方法，該方法快速、高效、簡便、分離量大，適于工業(yè)規(guī)模化。本發(fā)明的一種利用鈷離子金屬螯合親和膜純化木瓜蛋白酶的方法，包括(1) 尼龍膜的改性尼龍膜先在25°C 1 M HC1中水解24 h，然后浸入20 ml甲醛溶 液，加入0.2 ml 85wt.。/。磷酸，于60。C反應(yīng)7 h， 40 50。C熱水洗滌，再浸入10 ml 1 wt% 2wt。/。的殼聚糖溶液中，室溫反應(yīng)lh后，轉(zhuǎn)入烘箱60 90。C烘千1 h，分別用1.0voP/0 5.0 vol。/。醋酸和去離子水洗滌；(2) 尼龍膜螯合金屬鈷離子將改性后的尼龍膜浸入4 5ml環(huán)氧氯丙烷、40~55ml 氫氧化鈉和3~6mmol硼氫化鈉的混合溶液中，室溫反應(yīng)1 3 h后，加入20 30ml環(huán)氧氯丙 烷溶液和40~50ml氫氧化鈉溶液，繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)8~18 h，洗滌后再將上述膜浸入 110 120ml碳酸鈉、6 9mmol硼氫化鈉和80 90mmol偶聯(lián)劑亞氨基二乙酸(IDA)的混合溶液，50 7(TC反應(yīng)10~15 h，最后浸入500ml 50 150 ppm的氯化鈷溶液，反應(yīng)1 3 h， 得到螯合鈷離子的金屬親和膜；(3) 蛋白酶的吸附洗脫將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動(dòng)泵送入緩沖液 和洗脫液，以0.05mol/LpH二8.0的Tris-HCl緩沖液平衡15min，流速2.0ml/min;接著送 入100ml 0.25 2.0 mg/ml pH{t=5.0 10.0的木瓜蛋白酶溶液，其中氯化鈉濃度為0 2.0 mol/L，反應(yīng)10 100min進(jìn)行吸附，然后以Tris-HCl緩沖液洗去未吸附上的蛋白質(zhì)，最后 以洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到木瓜蛋白酶；(4) 測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算純化倍數(shù)。所述的步驟(1 )中殼聚糖溶液是以0.5 vol.% 2.0 vol.y。醋酸溶解。 所述的步驟(2)中環(huán)氧氯丙烷濃度為95wt%~100wt%，氫氧化鈉和碳酸鈉溶液的濃度 為1 3mol/L;環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與硼氫化鈉的混合溶液中，三者的體積比為0.9 l.l:8 11: 0扁 0扁。所述的步驟(2)中洗滌分別用去離子水和4.0vol^ 8.0vol。/o的醋酸洗滌。 所述的步驟(3)中最佳提純條件為反應(yīng)時(shí)間為30min， pH=9.0，木瓜蛋白酶的吸附濃度為2.0mg/ml，離子強(qiáng)度為Omol/L的氯化鈉溶液，即木瓜蛋白酶溶液中不含氯化鈉溶液。所述的步驟(3)中洗脫劑為硫氰酸鈉或氯化鈉，洗脫劑離子強(qiáng)度為0 2.0mol/L，洗 脫緩沖液的pH=3.0~9.0。所述的歩驟(3)中最佳洗脫條件為洗脫劑為1.0mol/L的硫氰酸鈉，洗脫緩沖液的 pH = 5,0。有益效果(1) 本發(fā)明方法操作簡單，快速、高效、分離量大，純化倍數(shù)和酶活性較高；(2) 原料來源方便，便于工業(yè)大規(guī)模提取純化。


圖1為不同反應(yīng)時(shí)間的木瓜蛋白酶溶液吸附曲線； 圖2為不同pH的木瓜蛋白酶溶液吸附曲線； 圖3為不同濃度的木瓜蛋白酶溶液的吸附曲線； 圖4為不同離子強(qiáng)度的木瓜蛋白酶溶液吸附曲線； 圖5為不同洗脫劑對木瓜蛋白酶的洗脫曲線；圖6為不同濃度的硫氰酸鈉的洗脫曲線圖7為不同pH緩沖液的洗脫劑對木瓜蛋白酶的洗脫曲線；圖8為最佳洗脫條件對木瓜蛋白酶的洗脫曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實(shí)施例l尼龍膜的活化和鍵合殼聚糖進(jìn)行改性，具體步驟如下(1) 尼龍膜先在25'C 1 MHC1中水解24h，然后用甲醛進(jìn)行活化。IO張水解的尼龍 膜浸入20ml甲醛溶液(〉36.5wt.%)，加入0.2 ml磷酸(85wt.%)，于60。C反應(yīng)7h， 40 5(TC熱水水洗多次。(2) 將上述甲醛活化的尼龍膜，浸入10ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的殼聚糖溶液(以lvol.% 醋酸溶解)，室溫反應(yīng)lh，然后轉(zhuǎn)入8(TC烘箱，lh后取出，分別用lvo"/。醋酸和去離子 水洗去未反應(yīng)的殼聚糖。尼龍膜上的殼聚糖含量可按茚三酮的方法進(jìn)行測試。實(shí)施例2改性后的尼龍膜螯合金屬鈷離子，具體歩驟如下(1) 上述改性后的IOO張(大約10克)尼龍膜浸入4.6ml環(huán)氧氯丙烷、46ml2mol/L 的氫氧化鈉和5mmo1硼氫化鈉混和液中，室溫反應(yīng)2 h后，再直接向混和液加入23 ml環(huán) 氧氯丙垸、46ml2mol/L的氫氧化鈉，6(TC反應(yīng)12h，用去離子水洗多次。(2) 將上述結(jié)合環(huán)丙垸的10張膜(大約1克)浸入含有86 mmol的亞氨基二乙酸 (IDA)、 8mmo1硼氫化鈉和114.4 ml 2 mol/L的碳酸鈉的混合溶液，6(TC恒溫振蕩反應(yīng)12h，用去離子水、5vol.。/。醋酸和去離子水洗多次。(3) 將上述的膜浸入500ml 100ppm的氯化鈷溶液，反應(yīng)2h，就可得到螯合鈷離子 的金屬膜。實(shí)施例3用金屬螯合膜吸附木瓜蛋白酶，進(jìn)行條件優(yōu)化，具體步驟如下 (1)反應(yīng)時(shí)間的確定。將IO張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動(dòng)泵送入100ml1.0 mg/ml木瓜蛋白酶的Tris-HCl溶液(pH = 8)，流速為2.0 ml/min，分別反應(yīng)10min， 20 min， 30min， 40min， 50min， 60min， 80min和100min，進(jìn)行吸附，測定木瓜蛋白酶吸附 的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖l，最適的反應(yīng)時(shí)間選擇在30min。(2) 反應(yīng)pH的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動(dòng)泵送入100ml 不同pH值的1.0 mg/ml木瓜蛋白酶的Tris-HCl溶液，循環(huán)反應(yīng)2 h，流速為2.0 ml/min， 加入木瓜蛋白酶的Tris-HCl溶液的pH值分別為5.0， 6.0， 7.0， 8.0， 9.0， IO.O進(jìn)行吸附， 測定木瓜蛋白酶吸附的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2，最適的反應(yīng)pH選擇在9.0。(3) 反應(yīng)起始木瓜蛋白酶溶液濃度的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜 橋，以蠕動(dòng)泵送入從100ml 0.25 mg/ml到2.0 mg/ml濃度不等的木瓜蛋白酶反應(yīng)液，循環(huán) 反應(yīng)2h，流速為2.0 ml/min，測定木瓜蛋白酶吸附的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，最佳吸附濃度 為2.0mg/ml的木瓜蛋白酶反應(yīng)液。(4) 反應(yīng)離子強(qiáng)度的確定。將10張改性尼龍膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動(dòng)泵送 入含有不同量氯化鈉的100ml 1.0 ppm的木瓜蛋白酶溶液，循環(huán)反應(yīng)2 h，流速為2.0 ml/min，所加入的氯化鈉濃度為0， 0.25， 1.0， 1.5， 2.0mol/L (即離子強(qiáng)度)，測定木瓜蛋 白酶吸附的量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，最佳離子強(qiáng)度為Omol/L的氯化鈉溶液(即不含氯化鈉溶 液)。實(shí)施例4用金屬螯合膜吸附木瓜蛋白酶后，對其洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，具體歩驟如下(1) 洗脫劑的確定。將10張吸附木瓜蛋白酶的膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動(dòng)泵 送入1.0mol/L的硫氰酸鈉和氯化鈉緩沖液(Tris-HCl， pH = 5.0)溶液，流速為2.0ml/min， 進(jìn)行洗脫，測定木瓜蛋白酶洗脫的量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5，最佳洗脫劑為硫氰酸鈉。(2) 洗脫劑離子強(qiáng)度的確定。將10張吸附木瓜蛋白酶的膜上疊成膜堆，放入膜橋， 以蠕動(dòng)泵送入硫氰酸鈉緩沖液(Tris-HCl， pH=5.0)溶液，流速為2.0 ml/min，所加入的 硫氰酸鈉濃度為0， 0.25， 0.5， 1.0， 2.0mol/L (即離子強(qiáng)度)，進(jìn)行洗脫，測定木瓜蛋白酶 洗脫的量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6，洗脫劑的最佳離子強(qiáng)度為1.0mol/L。(3) 洗脫劑緩沖液pH的確定。將10張吸附木瓜蛋白酶的膜上疊成膜堆，放入膜橋， 以蠕動(dòng)泵送入硫氰酸鈉緩沖液(Tris-HCl)溶液，流速為2.0 ml/min，所選擇的緩沖液pH 值為3.0， 5.0， 7.0， 9.0,進(jìn)行洗脫，測定木瓜蛋白酶洗脫的量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7，緩沖液 的最佳pH為5.0。實(shí)施例5用1.0mol/L的硫氰酸鈉溶液洗脫吸附木瓜蛋白酶的膜，具體步驟如下 將10張吸附木瓜蛋白酶的膜上疊成膜堆，放入膜橋，以蠕動(dòng)泵送入1.0mol/L的硫氰酸鈉緩沖液(Tris-HCl， pH = 5.0)溶液，流速為2.0 ml/min，進(jìn)行洗脫，測定木瓜蛋白酶洗脫的量，得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脫率都在95%以上。實(shí)施例6螯合膜組成膜堆對木瓜蛋白酶進(jìn)行分離純化包括如下步驟10張上述方法制備的金屬螯合膜上疊成膜堆，作為分離介質(zhì)，放入一種過濾容器膜橋， 以分離木瓜蛋白酶。以蠕動(dòng)泵送入緩沖液和洗脫液等。首先以0.05 mol/LTris-HCl緩沖液 (pH9.0)平衡15min，流速1.0ml/min;接著送樣，30ml的1.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液， 然后以0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)洗去未吸附上的蛋白質(zhì)。最后以0.05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH5.0)配制的1.0 mol/LNaSCN進(jìn)行洗脫，得到目標(biāo)蛋白質(zhì)木瓜蛋白酶， 其純化倍數(shù)為18.2。實(shí)施例7精確稱取一定量按上述方法制備的金屬螯合膜，置于0.05mol/L，不同pH值的緩沖液 配制的木瓜蛋白酶溶液中，室溫震蕩不同時(shí)間后，測量吸附前后蛋白質(zhì)溶液在280nm下的 吸光度，按下式計(jì)算吸附量《=(Ci-Ct)Ks/mg是吸附在單位膜量上的木瓜蛋白酶的量(mg/g); C,和Ct是吸附前和吸附后木瓜蛋白酶溶 液的濃度；R是木瓜蛋白酶溶液的體積；m是反應(yīng)的膜的質(zhì)量。
權(quán)利要求
1.一種利用鈷離子金屬螯合親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，包括(1)尼龍膜的改性尼龍膜先在25℃1M HCl中水解24h，然后浸入20ml甲醛溶液，加入0.2ml 85wt.％磷酸，于60℃反應(yīng)7h，40～50℃熱水洗滌，再浸入10ml 1wt％～2wt％的殼聚糖溶液中，室溫反應(yīng)1h后，轉(zhuǎn)入烘箱60～90℃烘干1h，分別用1.0vol％～5.0vol％醋酸和去離子水洗滌；(2)尼龍膜螯合金屬鈷離子將改性后的尼龍膜浸入4～5ml環(huán)氧氯丙烷、40～55ml氫氧化鈉和3～6mmol硼氫化鈉的混合溶液中，室溫反應(yīng)1～3h后，加入20～30ml環(huán)氧氯丙烷溶液和40～50ml氫氧化鈉溶液，繼續(xù)恒溫振蕩反應(yīng)8～18h，洗滌后再將上述膜浸入110～120ml碳酸鈉、6～9mmol硼氫化鈉和80～90mmol偶聯(lián)劑亞氨基二乙酸IDA的混合溶液，50～70℃反應(yīng)10～15h，最后浸入500ml 50～150ppm的氯化鈷溶液，反應(yīng)1～3h，得到螯合鈷離子的金屬親和膜；(3)蛋白酶的吸附洗脫將金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動(dòng)泵送入緩沖液和洗脫液，以0.05mol/L pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液平衡15min，流速2.0ml/min；接著送入100ml 0.25～2.0mg/ml pH值＝5.0～10.0的木瓜蛋白酶溶液，其中氯化鈉濃度為0～2.0mol/L，反應(yīng)10～100min進(jìn)行吸附，然后以Tris-HCl緩沖液洗去未吸附上的蛋白質(zhì)，最后以洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到木瓜蛋白酶；(4)測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算純化倍數(shù)。
2.0ml/min;接著送 入100ml 0.25 2.0 mg/ml pH值二5.0 10.0的木瓜蛋白酶溶液，其中氯化鈉濃度為0 2.0 mol/L，反應(yīng)10 100min進(jìn)行吸附，然后以Tris-HCl緩沖液洗去未吸附上的蛋白質(zhì)，最后 以洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到木瓜蛋白酶；(4) 測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算純化倍數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鈷離子金屬螯合親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在 于所述的步驟(1)中殼聚糖溶液是以0.5vol.。/。 2.0vol.。/。醋酸溶解。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鈷離子金屬螯合親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在 于所述的步驟(2)中環(huán)氧氯丙烷濃度為95wt% 100wt%，氫氧化鈉和碳酸鈉溶液的 濃度為1 3 mol/L;環(huán)氧氯丙垸、氫氧化鈉與硼氫化鈉的混合溶液中，三者的體積比 為0.9 1.1: 8 11: 0.003 0.005。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鈷離子金屬螯合親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在 于所述的歩驟(2)中洗滌分別用去離子水和4.0voP/。 8.0voP/。的醋酸洗滌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鈷離子金屬螯合親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在 于所述的歩驟(3)中提純條件為反應(yīng)時(shí)間為30min, pH = 9.0，木瓜蛋白酶的吸 附濃度為2.0 mg/ml，離子強(qiáng)度為Omol/L的氯化鈉溶液，即木瓜蛋白酶溶液中不含氯 化鈉溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用鈷離子金屬螯合親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在于所述的步驟(3)中洗脫劑為硫氰酸鈉或氯化鈉，洗脫劑離子強(qiáng)度為0-2.0mol/L， 洗脫緩沖液的pH二3.0 9.0。 7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用鈷離子金屬螯合親和膜提純木瓜蛋白酶的方法，其特征在 于所述的洗脫劑為1.0mol/L的硫氰酸鈉，洗脫緩沖液的pH二5.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用鈷離子金屬螯合親和膜純化木瓜蛋白酶的方法，包括(1)活化的尼龍膜經(jīng)殼聚糖鍵合改性；(2)改性后的尼龍膜與環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉和硼氫化鈉的混合溶液反應(yīng)，再將上述膜分別浸入碳酸鈉、硼氫化鈉和偶聯(lián)劑的混合溶液和氯化鈷溶液，得到螯合鈷離子的金屬親和膜；(3)將上述金屬親和膜上疊成膜堆，放入膜橋，蠕動(dòng)泵送入Tris-HCl緩沖液和洗脫液，接著送入木瓜蛋白酶溶液，然后以洗脫劑進(jìn)行洗脫，得到木瓜蛋白酶；(4)測試酶活性和蛋白質(zhì)含量，計(jì)算純化倍數(shù)。本發(fā)明方法快速、高效、簡便、分離量大，提取的酶活性好，適用于工業(yè)規(guī)?；?。
文檔編號(hào)C12N9/50GK101402949SQ200810041038
公開日2009年4月8日 申請日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者何智妍, 周毓婷, 朱利民, 聶華麗, 胡映清 申請人:東華大學(xué)