一種鄰苯二甲酸二丁酯的化學發(fā)光檢測試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的化學發(fā)光檢測（CLEIA）試劑盒，包括盒體，設在盒體內的反應杯和設在盒體內的試劑；所述試劑包括：酶標抗原工作液，磁標抗體工作液，DBP系列標準品溶液，化學發(fā)光底物A、B液，濃縮洗滌液，濃縮樣品稀釋液；本發(fā)明的化學發(fā)光酶免疫檢測試劑盒具有高靈敏度、簡便快速、準確度高的特點，與傳統(tǒng)的ELISA法比較，操作時間大幅度減少?？捎米鳈z測白酒中DBP殘留檢測。
【專利說明】一種鄰苯二甲酸二丁酯的化學發(fā)光檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的化學發(fā)光酶免疫檢測試劑盒，用于檢測白酒中的DBP含量或殘留量。屬于免疫學檢測領域。
【背景技術】
[0002]鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)屬于鄰苯二甲酸酯類，是目前國內外工業(yè)生產中使用最多的塑化劑(又稱增塑劑)，廣泛存在于食品包裝、化妝品、醫(yī)療器材以及環(huán)境水體中。這類塑化劑并非食品或食品添加物，但會通過環(huán)境遷移、食品包裝遷移及非法添加等進入食品，對人體健康產生毒害作用，如造成內分泌失調，影響正常生育能力，在體內長期蓄積會導致畸形、癌變和突變，對心血管、消化和泌尿系統(tǒng)也有很大傷害。因此，我國衛(wèi)生部衛(wèi)辦監(jiān)督函〔2011〕551號文件中規(guī)定:嚴禁在食品、食品添加劑中人為添加鄰苯二甲酸酯類物質，食品、食品添加劑中的鄰苯二甲酸二( α-乙基已酯)(DEHP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)和鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)最大殘留量分別為1.5mg/kg、9.0mg/kg和0.3mg/kg。
[0003]目前文獻報道有關鄰苯二甲酸酯類物質的檢測方法有氣相色譜法、超高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜法、氣相色譜-離子阱質譜法等。但研究大多集中于環(huán)境樣品和塑料包裝材料，對于食品中的污染情況檢測研究較少。我國食品中鄰苯二甲酸酯檢測使用“GB/T 21911-2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》”，包裝中鄰苯二甲酸酯檢測使用“GB/T 21928-2008《食品塑料包裝材料中鄰苯二甲酸酯的測定》”，兩種檢測方法均運用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)的方法進行測定。該方法靈敏、準確，特異性強、分離度好，可以同時測定多種藥物，但需要昂貴的儀器、樣品的前處理復雜、繁瑣費時、檢測的成本較高，不能現場操作，而且需專業(yè)人員操作，所以限制了其應用。與之相比，化學發(fā)光酶免疫測定法具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合于批量樣品的篩選檢測等優(yōu)點，而且所需設備少，操作簡單易學，成本低廉，能夠更好地滿足我國食品企業(yè)、政府職能監(jiān)管部門等開展檢測工作。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種DBP的化學發(fā)光酶免疫檢測試劑盒。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應用靈活、方便的特點，可用于白酒中DBP的殘留量檢測。
[0005]為實現上述目的，本發(fā)明主要是利用抗原與抗體的特異性免疫反應的基本原理來實現的?；瘜W發(fā)光免疫分析法是化學發(fā)光法和免疫分析法結合的產物，因此同時具有化學發(fā)光法的高靈敏性和免疫分析法的高特異性。在整個反應過程中，樣品中DBP含量越高，反應體系中發(fā)光強度越弱；反之，樣品中DBP含量越少，發(fā)光強度越高。
[0006]本發(fā)明的檢測DBP的化學發(fā)光酶免疫檢測試劑盒含有盒體，設在盒體內的反應杯和設在盒體內的試劑。具體含有以下成分:
[0007]反應杯為白色不透明的塑料反應微孔，固定于黑色外框支撐架上，放于自封袋內。
[0008]應用ρΗ=7.4 0.05 mo I/L的PBS溶液稀釋DBP純品得到的DBP系列標準品溶液，濃度范圍至少包含了 0.02^1.62mg/L的濃度區(qū)間。
[0009]酶標抗原工作液。是由DBP與OVA偶合制成的偶聯物與辣根過氧化物酶反應獲得。
[0010]磁標抗體工作液。由DBP與BSA偶合制成的偶聯物作為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得抗體后與免疫磁珠反應獲得。
[0011]化學發(fā)光發(fā)光底物液。發(fā)光底物液分為A、B液。A液為化學發(fā)光底物-魯米諾和發(fā)光增強劑-對甲苯酚溶液，B液為過氧化氫脲溶液。
[0012]濃縮樣品稀釋液。濃縮復溶液具體為2倍濃縮磷酸鹽緩沖液，使用前用雙蒸水稀釋至工作濃度后使用，用于樣品前處理。
[0013]濃縮洗滌液。濃縮洗滌溶液具體為含有吐溫-20 (Tween-20)緩沖液的20倍濃縮磷酸鹽緩沖液，使用前用雙蒸水稀釋至工作濃度后使用，用于實驗過程中洗滌化學發(fā)光板。
[0014]本發(fā)明溶液的配制:
[0015]本發(fā)明試劑盒中涉及的DBP標準品溶液、抗體工作液、化學發(fā)光溶液及洗滌溶液及其配方對本發(fā)明試劑盒檢測的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是:
[0016]1、DBP標準溶液:以常規(guī)方法將DBP純品用0.05 mol/L, pH=7.4的PBS配制成濃度分別為 0,0.02,0.06,0.18,0.54、1.62 mg/L 的 DBP 標準溶液。
[0017]2、酶標抗原工作液:用DBP與OVA偶聯制備的偶聯物與辣根過氧化物酶偶聯制備得到。用PH7.6的磷酸鈉為0.01M、NaCl為0.25M的緩沖溶液稀釋至工作濃度。
[0018]3、磁標抗體工作液:由DBP與BSA偶合制成的偶聯物作為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得抗體后與免疫磁珠反應獲得。用PH7.6的磷酸鈉為0.01M、NaCl為0.25M的緩沖溶液稀釋至工作濃度。
[0019]4、化學發(fā)光溶液A液:將魯米諾溶于對甲苯酚含量為0.0OlM pH=8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液中，使其終濃度為0.01M。
[0020]5、化學發(fā)光溶液B液:將0.75%的過氧化氫脲0.64mL溶于每IOOmL溶液含檸檬酸
2.lg，無水Na2HPO4 2.82g的水溶液。
[0021]6、濃縮樣品稀釋液=NaH2PO4.2Η20 5.74g,Na2HPO4.12H20 32.6g 溶于 IL 的去離子水中。
[0022]7、濃縮洗滌溶液:按體積分數0.05%將吐溫-20添加至pH=7.4,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中。
[0023]磁標抗體工作液的制備:
[0024]本發(fā)明中磁標抗體工作液濃度是決定本發(fā)明中DBP酶免疫檢測試劑盒測定范圍及靈敏度的重要因素。
[0025]按照上述磁標抗體工作液濃度制備的試劑盒可以達到很好的線性范圍(標準線范圍可以達到0.02~1.62 mg/L)和很好的靈敏度(IC50浮動范圍為0.065~0.110mg/L)。
[0026]化學發(fā)光溶液的配制:
[0027]本發(fā)明采用辣根過氧化酶標記底物發(fā)光系統(tǒng)，主要是魯米諾-過氧化氫系統(tǒng)。
[0028]所述化學發(fā)光液A液為魯米諾含量為0.01M、對甲苯酚含量為0.0OlM pH=8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液液為IOOmL溶液含檸檬酸2.1g,無水Na2HP04 2.82g，0.75%的過氧化氫脲0.64mL的水溶液。所述魯米諾為化學發(fā)光底物，對甲苯酚為發(fā)光增強劑。[0029]本發(fā)明的原理是將抗體-抗原反應的高度特異性與酶催化的高度靈敏性結合起來，利用酶催化底物的化學發(fā)光反應檢測產物濃度。在反應杯中加入樣本溶液或標準品溶液后，再加入酶標抗原工作液和磁標抗體工作液，樣本中的DBP與酶標抗原(DBP-OVA)競爭抗DBP特異性抗體，用化學發(fā)光底物液顯色，樣本發(fā)光度值與DBP的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得到樣本中DBP的殘留量。
[0030]本發(fā)明還提供了一種應用上述化學發(fā)光酶免疫試劑盒檢測DBP的方法，它包括步驟:
[0031](I)樣品前處理；
[0032](2)用試劑盒進行檢測；
[0033]( 3 )分析檢測結果。
[0034]本發(fā)明的化學發(fā)光酶免疫檢測試劑盒具有靈敏度高、簡便快速、準確的特點，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個數量級。有望在白酒中的DBP殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為本發(fā)明DBP半抗原合成反應式。
[0036]圖2為本發(fā)明DBP半抗原核磁共振氫譜圖。
[0037]圖3為本發(fā)明CLEIA試劑盒工作曲線。
【具體實施方式】`
[0038]實施例1:半抗原、抗原及單克隆抗體的制備
[0039]( I) DBP半抗原合成
[0040]取0.5 g DBP,0.50 g鄰苯二甲酸酐和2 mL吡啶溶于20 mL DMSO中，在60°C下攪拌反應4小時，反應完成后，加熱蒸除溶劑，柱層析純化得到鄰苯二甲酸單DBP酯。將1.48g鄰苯二甲酸酐溶入50ml三氯甲烷中，攪拌下滴加入3ml 1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0] 十一碳-7-烯(DBU)和1.0ml正丁醇在IOml三氯甲烷中的混合液，室溫攪拌6h，蒸除溶劑后，柱層析純化得到鄰苯二甲酸單丁酯；將1.1lg鄰苯二甲酸單丁酯溶入40ml三氯甲烷中，加入2.06g 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，催化量的4- 二甲氨基吡啶(DMAP)，攪拌下緩慢滴加入
0.Sg 4-氨基丁酸在20ml三氯甲烷中的懸浮物，加畢繼續(xù)室溫反應8h，過濾，水洗，蒸干溶劑后柱層析純化得到鄰丁氧酰基羧丁基苯甲酰胺，即為鄰苯二甲酸二丁酯半抗原。
[0041]取上述產物經核磁共振氫譜測定，如圖2所示，12.0ppm左右的羧基信號峰，
8.5ppm左右的亞氨基信號峰,8.0ppm左右的兩組芳環(huán)信號峰以及0.8-4.3ppm的烷基信號峰說明半抗原合成成功。
[0042](2 ) DBP-BSA 的合成
[0043]取IOmg半抗原，溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)中；取15mg碳化二亞胺(EDC)用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液A ;稱取BSA30mg，使之充分溶解在3ml 0.lmol/L CB (pH 9.6)中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0.01mol/L PBS 4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩0044](3 ) DBP-OVA 的合成
[0045]取IOmg半抗原，溶解于Iml DMF中；取15mg EDC用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應液A ;稱取OVA 30mg，使之充分溶解在3ml
0.lmol/L CB (pH 9.6)中，將反應液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0.01mol/L PBS 4°C透析3d,每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0046](4) DBP單克隆抗體的制備
[0047]A，動物免疫:用上述制備出的免疫原(DBP-BSA)按100 μ g/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫61周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以免疫復合物100 μ g/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。
[0048]B，細胞融合:按常規(guī)方法進行，取免疫小鼠的脾細胞與處于對數生長期的小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)混合，然后在45秒內緩慢加入預熱的融合劑(PEG4000)進行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時候進行全換液。
[0049]C，雜交瘤細胞的篩選:細胞融合后，待細胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初選采用間接ELISA方法，以包被抗原(預先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽性血清稀釋度)包被化學發(fā)光板，加入被測孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD進行顯色反應。篩選出的陽性孔再用間接競爭ELISA方法篩選，先將細胞上清與100 μ g/mL的DBP等體積混合，37°C水浴作用30min，再加入到包被好的化學發(fā)光板中。同時用PBS取代DBP作對照，其余步驟同上。若經DBP阻斷后的0D450nm值下降到對照孔的50%以下，則判為陽性，經2?3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進行亞克隆化。
[0050]D，細胞凍存和復蘇:將單克隆雜交瘤細胞株用凍存液制成I X 106個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。
[0051]E，單克隆抗體的生產與純化:將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細胞株5X 105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，-20°C保存。
[0052]實施例2:酶標抗原的制備
[0053]A，稱取2 mg HRP溶解于0.5 mL雙蒸水中；加入0.5 mL新配制的0.06 mol/L NaIO4溶液，4°C避光作用30 min ；
[0054]B,加入 160 mmol/L 的乙二醇 0.5 mL,室溫作用 30 min ；
[0055]C,加入DBP-0VA2 mg,混勻后裝入處理過的透析袋中，置1000 mL的0.05 m mol/L碳酸鈉緩沖液中透析，4°C過夜；
[0056]D,透析液吸至10 mL的離心管中，加0.25mL新配的5g/L NaBH4液，混勻后置4°C 2h ;加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4°C作用30 min,在4°C下3000 rpm離心25 min,棄上清；
[0057]E，將沉淀溶于 1.5mL 0.02 mol/L pH 7.4 PBS 中，吸入透析袋內，在0.02mol/L pH
7.4 PBS透析，4°C過夜(中途更換PBS 3次)；[0058]F，將透析液中液體吸至微量離心管中，4°C下IOOOOrpm離心30 min，將上清液吸出，加等量甘油，混勻，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0059]實施例3:磁標抗體工作液的制備
[0060]A，采用二步膨脹法制備磁珠，具體步驟是:以自由基聚合法合成聚苯乙烯種子聚合液。聚合體系包括:苯乙烯、氯化鈉、過硫酸鉀和蒸餾水。
[0061]B，于70°C聚合24h后，得到平均孔徑為1.5 μ m、分散度為0.025左右的聚苯乙烯粒子；將上述粒子懸液快速透析后，加入膨脹體系(包括:SDS、二氯乙烷和丙酮等)，于35°C膨脹12h，形成膨脹種子液。
[0062]C，取適量膨脹液進行二步聚合后，即得到聚苯乙烯微球；將聚苯乙烯微球硝化后，與FeCl2反應并使之磁化。
[0063]D，將磁化微球通過適當的分子篩，便可得到粒度、分散度適宜的磁性微球。
[0064]E，向磁性微球懸液中加入丙烯醛，經電子加速器照射使微球表面形成一層活性膜后，與抗體共同孵育12h。再以MPC磁力架回收磁珠，即為免疫磁珠。結合抗體后的免疫磁珠保存于含10g/L OVA的PBS緩沖液中，以封閉磁珠表面未被結合的活性基團，減少在應用過程中磁珠與無關生物物質的非特異性結合。
[0065]實施例4:檢測DBP的化學發(fā)光酶免疫試劑盒的組成
[0066]A,反應杯。
[0067]B, DBP 標準品溶液:0,0.02,0.06,0.18,0.54、1.62mg/L。
[0068]C，酶標抗原工作液。
[0069]D,磁標DBP單克隆抗體工作液。
[0070]E，發(fā)光溶液:A液為魯米諾、對甲苯酚溶液，B液過氧化氫脲溶液，使用時A液、B液等體積混勻，現配現用。
[0071]F，2倍濃縮樣品稀釋液液，使用時用雙蒸水稀釋至工作濃度。
[0072]G，20倍濃縮洗滌溶液:使用時用雙蒸水稀釋至工作濃度。
[0073]實施例5:檢測DBP的化學發(fā)光酶免疫試劑盒的應用
[0074](I)試劑的配制
[0075]A，洗滌溶液:將試劑盒中提供的濃縮洗滌液用去離子水按1:19倍稀釋后使用。
[0076]B，樣品稀釋液:將試劑盒中提供的濃縮磷酸鹽緩沖液用去離子水按1:1倍稀釋后使用。
[0077]C，化學發(fā)光溶液:將A液與B液按體積比1:1混勻，現配現用。
[0078](2)白酒樣品前處理
[0079]移取200 μ L白酒樣品于2mL聚苯乙烯離心管中，再加入800 μ L樣本稀釋液，充分振蕩混勻；取50 μ L用于分析。
[0080](3)檢測步驟
[0081]Α，將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，按照上述方法進行回溫，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
[0082]B，濃縮洗滌液和樣本稀釋液在使用前也需按上述方法回溫。
[0083]C，加標準品/樣本50 μ I到對應的反應杯孔中，然后加入酶標抗原工作液50 μ I/孔，再加入磁標抗體工作液50 μ I/孔，25°C環(huán)境中反應20min。[0084]D，每孔加入洗滌工作液250 μ L，振蕩IOs后，甩干，重復洗滌4_5次。
[0085]Ε，每孔加入化學發(fā)光溶液100 μ L，振蕩30秒后放置3分鐘。
[0086]F，用全自動化學發(fā)光免疫分析儀讀數。
[0087](4)結果判斷
[0088]A，發(fā)光百分比的計算，標準品或樣本的發(fā)光百分比等于標準品或樣本的發(fā)光強度值的平均值(雙孔)除以O濃度標準品的發(fā)光強度度值，再乘以100%，即
[0089]
【權利要求】
1.一種鄰苯二甲酸二丁酯的化學發(fā)光檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的反應杯和設在盒體內的試劑；其特征在于，所述試劑包括:酶標抗原工作液，磁標抗體工作液，DBP系列標準品溶液，化學發(fā)光底物A、B液，濃縮洗滌液，濃縮樣品稀釋液。
2.根據權利要求1所述化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于:反應杯為白色不透明的塑料反應微孔，固定于黑色外框支撐架上，放于自封袋內。
3.根據權利要求1所述化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于:所述酶標抗原工作液是由DBP與OVA偶聯制備的偶聯物與辣根過氧化物酶偶聯制備得到。
4.根據權利要求1所述化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于:所述磁標抗體是由DBP與BSA偶合制成的偶聯物作為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得抗體后與免疫磁珠反應獲得。
5.根據權利要求1所述化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于:所述DBP系列標準品溶液濃度分別為:0,0.02,0.06,0.18,0.54、1.62mg/L。
6.根據權利要求1所述化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于:所述濃縮樣品稀釋液具體為濃縮磷酸鹽緩沖液，是每升含NaH2PO4.2H20 5.74 g、Na2HPO4.12H20 32.6 g的水溶液。
7.根據權利要求1所述化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于:所述濃縮洗滌溶液是含有體積分數0.05%吐溫-20的pH=7.4，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液。
8.根據權利要求1所述化學發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于:所述化學發(fā)光液A液為魯米諾含量為0.01M、對甲苯酚含量為0.0OlM pH=8.8的三(羥甲基)氨基甲烷溶液；B液為每IOOmL溶液含梓檬酸2.1g,無水Na2HPO4 2.82g, 0.75%過氧化氫脲0.64mL的水溶液,所述百分比為質量百分比。
【文檔編號】G01N33/577GK103869069SQ201210540682
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月14日 優(yōu)先權日:2012年12月14日
【發(fā)明者】何方洋, 萬宇平, 馮才偉, 馮月君, 朱亮亮, 馮靜, 孫震 申請人:北京勤邦生物技術有限公司